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dzxy7678鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
SYBR熒光定量擴(kuò)增曲線異常
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| 擴(kuò)增曲線從左到右濃度依次降低，5倍稀釋，熔解曲線中，有2個(gè)峰的是濃度最高的，請問，濃度最高的怎么跑成這樣？ |
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2012-09-14 20:05:10, 1.29 M
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atlanticwi
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 很久沒來了，辛苦 2012-09-17 16:44:39
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 很久沒來了，辛苦 2012-09-17 16:44:39
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嗯................ 補(bǔ)救有幾個(gè)方法： 1. 重新提，并注意洗滌步驟，乙醇洗兩次左右。如果是RNA的話，分光光度測量時(shí)注意260/230比值，不要低于1，低于1的話，鹽類雜質(zhì)太多肯定是干擾PCR進(jìn)程的。 2. 做標(biāo)曲好像是可以把頭尾的誤差較大的點(diǎn)去掉的，多做幾個(gè)梯度，以6~7個(gè)為宜，若除去原液的其他稀釋樣品都能成線性，且斜率接近-3.32，就不要原液這個(gè)點(diǎn)了，用之后的6個(gè)點(diǎn)做標(biāo)曲，但注意，若中間有點(diǎn)誤差太大的話是不能去掉的。必須重做。同時(shí)你最后待測樣品也一定要落在除掉原點(diǎn)后的6個(gè)點(diǎn)的線性范圍內(nèi)。 個(gè)人看法 若有說錯(cuò)請高手指點(diǎn) |
4樓2012-09-16 12:36:55
atlanticwi
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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嗯...................... 個(gè)人意見，如果系列稀釋中最高濃度樣品出現(xiàn)擴(kuò)增不正常的現(xiàn)象，往往是指你樣品中有PCR抑制物殘留，可能是樣品提取中有雜質(zhì)殘存，如果是RNA反轉(zhuǎn)錄過程，不正確的RT步驟也會有影響。隨著你稀釋的過程，抑制物濃度也會被稀釋到不影響PCR反應(yīng)的程度，隨后的幾個(gè)樣品擴(kuò)增也就正�；藒 如果有說錯(cuò)請其他高手指點(diǎn)，若你之后實(shí)驗(yàn)解決了這個(gè)問題，也請告知我 |
2樓2012-09-15 11:02:40
dzxy7678
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3樓2012-09-16 10:05:49
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