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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 微生物 » 實驗/技術 » 用試劑盒檢測奶粉中的葉酸
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liuchang_1鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
用試劑盒檢測奶粉中的葉酸
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| 各位大俠，請問下有誰使用過拜發(fā)試劑盒微生物法（96孔板）檢測奶粉中的葉酸，我們在使用的過程中重復性不好，在奶粉的前處理和使用酶標儀測定菌的濃度時標準曲線由于菌液的不均勻不斷變化，導致待測樣的濃度也會出現(xiàn)變化，具體應該有個什么樣的標準呢？謝謝！ |
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lichao5263
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【答案】應助回帖
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搜到的一篇文獻，用的不同方法，自己慢慢看吧！6個金幣，真小氣 Determination of folic acid in milk.pdf(133.14KB) http://kuai.xunlei.com/d/GLHWAFWYOIDQ?p=130497 |
2樓2012-11-20 01:33:02
lichao5263
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【答案】應助回帖
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VitaFast® Folic Acid 簡介 VitaFast® Folic Acid試劑盒簡單易用，采用微生物方法，在微孔板中定量檢測食品、藥品和飼料中的葉酸總量（包括添加和原生葉酸）。所有所需的試劑均包含在試劑盒中。本試劑盒共能提供96次檢測（包括標準品）。最后使用ELISA reader (610 - 630 nm 或者540 - 550 nm)進行讀數(shù)。 含添加葉酸的樣品處理： 液態(tài)樣品：無菌過濾和稀釋 固態(tài)樣品：均質、提�。x心）、無菌過濾和稀釋 含原生葉酸的樣品處理： 固態(tài)樣品：均質、酶化處理、提取、（離心）、無菌過濾和稀釋 所需時間：試驗過程…………………….約10分鐘 計算………………………….2分鐘 孵育： 黑暗、37 °C條件下44－48小時 標準范圍：0.16 - 1.28 μg / 100 g (ml) 回收率： 90 - 105 % Intra-assay CV for standards: < 10 % Inter-assay CV for standards: < 10 % 1． 產品用途 VitaFast® Folic Acid微孔板檢測試劑盒是利用微生物方法，用于定量檢測食品、藥品和飼料中的葉酸總量（包括添加和原生葉酸）。本微生物檢測系統(tǒng)符合EN14131標準。 2． 檢測原理 葉酸是從樣品稀釋提取所獲得的。將稀釋了的提取物和葉酸檢測培養(yǎng)基加入包被有鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus (ATCC Nr. 7469)的微孔中。Lactobacillus rhamnosus的生長狀況取決于葉酸的含量。添加葉酸作為標準或者作為樣品混合物，細菌會一直生長直至葉酸被消耗殆盡。孵育條件應為黑暗、37 °C條件下孵育44-48小時。細菌生長時新陳代謝的強度和葉酸的含量形成關系并可以繪制稱標準曲線，最后通過ELISA reader在610 - 630 nm (或者540 - 550 nm)讀取結果。 3. 檢測說明 水質在整個測試過程中起著十分重要的作用。本試劑盒中帶有作為溶劑的無菌蒸餾水，用于重組、稀釋標準品和樣品的提取。附加的蒸餾水在以上過程中都是必不可少的。 要求整個檢測過程中保持無菌操作。所使用的玻璃器皿保證無化學殘留物、清潔劑、化學物質和微生物污染。因此，玻璃器皿使用前先用3 mol / l的鹽酸漂洗，然后再用蒸餾水250 °C (482 °F)條件下加熱1小時。在使用前回至室溫。 樣品制備和提取可以不用在無菌條件下進行。樣品的過濾、稀釋與檢測前的準備工作則與整個檢測過程一樣必須在無菌條件下進行。 檢測的每一個步驟都需要校正。標準品和樣品應該進行3次檢測（注意：官方標準中推薦3次檢測方法）。未知樣品應該用2份提取物的稀釋液檢測（誤差應該小于10%）。如果在更高的稀釋液中葉酸含量更多，則可能含抑制劑，比如重金屬或者抗生素。 4. 提供試劑 每個試劑盒中包含： 1 x 96孔微孔板，包被有 Lactobacillus rhamnosus (ATCC Nr. 7469) 3 x 無菌蒸餾水 (30 ml) ，用于準備培養(yǎng)基、標準品和樣品提取稀釋液 3 x 葉酸培養(yǎng)基 (固體) 3 x 葉酸標準品 (固體) 3 x 葉酸緩沖液 (液體) 3 x 粘性箔 1 x 微孔板固定器 5. 需要試劑但試劑盒種不提供 −黑暗條件下的培養(yǎng)箱，37 °C (98.6 °F) −90 -100 °C (194 - 212 °F)水浴，或者高壓滅菌鍋 −ELISA reader 610 - 630 nm (540 - 550 nm) −pH 測量儀 −離心機，大約10000 x g −刻度移液槍 20 - 200 μl; 100 - 1000 μl −滅菌微量移液槍 tips 20 - 200 μl and 100 - 1000 μl −無菌燒瓶 1.5 - 2.0 ml −移液槍 5 or 10 ml −帶帽的無菌離心機管 (15 and 50 ml) −帶無菌注射器的0.2um無菌濾膜 −雙蒸水用于樣品提取(available at ifp) −濃縮NaOH −1 mol / l NaOH (0.4 g 溶解于100 ml水中) 檢測原生葉酸所需試劑 −胰液素(Sigma P1750) −磷酸(鹽)緩沖液(0.5 mol / ；0.1 % 抗壞血酸鹽)：溶解于1升水 7.8 g脫氫磷酸鈉二水化合物和1 g 抗壞血酸鈉, 校正pH值至7.2 6．用戶須知 −檢測培養(yǎng)基有可能刺激眼睛、皮膚和隔膜 −完成試驗后須根據(jù)規(guī)章處理檢測儀器（如使用高壓滅菌鍋） 7．貯藏條件 試劑盒應存放在2－8℃條件下 處理過的試劑（標準品、培養(yǎng)基）和葉酸緩沖液應馬上使用，并在檢測后丟棄 將未使用的微孔板條放回原來的箔袋中，并與干燥劑一起重新封好，放在2－8℃溫度下。微孔板須防止受潮或受到其他污染。 請勿在試劑盒標注的有效期之后使用。 8．試劑失效的跡象 空白的吸光度值大于標準品1 最高濃度標準品的吸光度值小于0.6（630nm） 9．樣品處理 樣品必須儲存在4℃、避光條件下。 檢測富集營養(yǎng)樣品中的游離葉酸時，熱水提取方法通常就足夠了。但是富集營養(yǎng)的飲料可以在過濾之后直接使用。由于使用熱水提取，所以原生葉酸只能被部分檢測。對于檢測原生V B12總量，樣品應進行緩沖和用酶水化處理。 樣品提取時需要1g或1ml樣品溶解于40ml雙蒸水或提取溶液中。相當于樣品的稀釋倍數(shù)為40，這個稀釋倍數(shù)已經(jīng)包括在標準曲線中。 樣品提取后需要進一步稀釋。稀釋倍數(shù)取決于由標準曲線中間部分顯示的標準濃度，它由期望的成分除以標準曲線中間區(qū)域所顯示的標準品濃度獲得（詳見產品標簽或認證，每100g或100ml濃度）。至于涉及到膠囊或藥片時，濃度時常表達為“/片膠囊”，此時濃度必須轉化成“/100g”（詳見11.的計算示例）。這個稀釋倍數(shù)在計算結果的時候必須考慮。 樣品提取時使用無菌濾膜（0.2μm）進行過濾，此時。如果由于固體顆�；蛘邷啙釋е逻^濾不順利，則在無菌過濾之前應先離心（至少在8000g的離心力下離心5分鐘）。 樣品提取液可以在提取當天使用，使用之前應避光保存。提取稀釋液應馬上使用。 9.1.液體樣品（富含維生素的果汁、健康飲品） 加入1ml樣品至50ml無菌離心管中，準確加入雙蒸水至40ml，搖勻。使用無菌0.2μm濾紙過濾1.0～1.5ml樣品到一個無菌試管中。是否進一步稀釋則取決于濃度范圍（詳見計算示例中的稀釋倍數(shù)）。 9.2.含維生素的可溶固體樣品（粉末、藥片） 稱取1g樣品至50ml無菌試管，用雙蒸水準確加至30ml刻度。搖勻至樣品溶解。用NaOH調整pH值至7.0～7.5。然后加無菌水精確至40ml。用0.2μm無菌濾紙過濾1.0～1.5ml樣品至一無菌試管中。是否進一步稀釋則取決于濃度范圍（詳見計算示例中的稀釋倍數(shù)）。 9.3.維生素膠囊、藥片 首先膠囊或藥片的重量必須確定（平均5～10個膠囊或藥片）。藥片用研缽或攪拌機均質，膠囊須切開并取出其中的顆粒進行試驗。 稱取1g藥片或切開1個膠囊至一個50ml無菌離心管中，用雙蒸水加至30ml，搖勻。用NaOH調整pH值至7.0～7.5。然后加無菌水精確至40ml。在90～100℃水浴中提取30分鐘。在提取時試管須振蕩至少5次。當然期間必須保證試管是否充分封閉。迅速降溫至30℃以下。使用0.2μm無菌濾膜過濾1.0～1.5ml樣品至一個無菌試管中。是否進一步稀釋則取決于濃度范圍（詳見計算示例中的稀釋倍數(shù)）。 9.4富含維生素的谷物、嬰兒食品、面包、面粉和食品添加劑 稱量1g均質過的樣品至一個50ml無菌試管中，加入雙蒸水至30ml，充分搖勻。用氫氧化鈉溶液調整其pH值至7.0-7.5，用雙蒸水加至40ml在90～100℃水浴中提取30分鐘。在提取時試管須振蕩至少5次。迅速冷卻至室溫。使用0.2μm無菌濾紙過濾1.0～1.5ml樣品至一個無菌試管中并進行進一步稀釋。 9.5.原生葉酸 提取復合物時，檢測含原生葉酸的樣品必須先經(jīng)過酶化處理。以下檢測過程已經(jīng)開始在檢測牛奶時使用。 稱取1g均質過的樣品至一個50ml無菌離心管中，用磷酸鹽緩沖液加至40ml（0.05mol/l；0.1％抗壞血酸鹽；pH7.2）。之后在90～100℃水浴中提取30分鐘。在提取時試管須振蕩至少5次。冷卻至室溫，加入10mg干胰液素。旋緊管蓋，搖勻，在37℃條件下培養(yǎng)24小時。隨后在90～100℃水浴中提取30分鐘。迅速冷卻至室溫。使用0.2μm無菌濾紙過濾1.0～1.5ml樣品至一個無菌試管中。是否進一步稀釋則取決于濃度范圍（詳見計算示例中的稀釋倍數(shù)）。 10.檢測過程 10.1.準備 裝有無菌水的瓶子：推開藍色帽，沿著玻璃邊緣垂直向上拉開，丟棄。 葉酸培養(yǎng)基：足夠進行至少6條微孔板試驗，培養(yǎng)基必須在試驗之前新鮮制備。打開瓶蓋用鑷子從干燥劑中取出培養(yǎng)基，丟掉干燥劑。 －加入10ml無菌水（取自試劑盒中）至葉酸培養(yǎng)基中。 －加入1ml葉酸緩沖液至培養(yǎng)基中。 －蓋好培養(yǎng)基瓶，搖勻。 －在90～100℃水浴中加熱至少5分鐘，期間振蕩至少2次；期間保證瓶子封閉。 －迅速冷卻至室溫（低于30℃）。 －使用0.2μm無菌濾紙過濾培養(yǎng)基至15ml無菌離心管中。 每個葉酸標準品都足夠進行至少3個孔的試驗。標準品必須在試驗之前新鮮制備。 －打開維生素B12標準品瓶，取出蓋子。丟掉蓋子和紅色塞子 －加入x ml（x＝詳見質量保證書）無菌水（取自試劑盒）至標準品瓶中。用移液管溶解標準品：用標準品瓶中的水沖洗移液管尖數(shù)次＝標準品濃縮液。 －取6個無菌管（1.5～2.0ml）并按照下列表格準備標準品溶液。 標準曲線 μg/100g(ml) 無菌水 μl 標準濃縮液 μl 總體積 μl 空白：0 900 ＋ 0 ＝ 900 標準品1：0.16 900 ＋ 100 ＝ 1000 標準品2：0.32 400 ＋ 100 ＝ 500 標準品3：0.64 300 ＋ 200 ＝ 500 標準品4：0.96 200 ＋ 300 ＝ 500 標準品5：1.28 100 ＋ 400 ＝ 500 10.2.檢測過程 －用移液管吸取150μl葉酸培養(yǎng)基至微孔中 －用移液管吸取150μl標準品或樣品至指定的微孔中（用標準品或樣品溶液沖洗移液管尖） －用粘合箔蓋住微孔條或微孔：除去粘合箔上的保護層，將其平放在微孔條上，用手或壓舌板將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條。 注意：保證粘合箔和微孔的封閉性，特別注意微孔的邊緣部分 －在37℃黑暗條件下（可用孵育器）孵育44～48小時 10.3.測量 －再次向下擠壓粘合箔，將微孔板向上放置在桌面上，在桌面平面上振蕩，使微生物溶解在培養(yǎng)基中 －對角揭去粘合箔，從左邊開始進行 －破壞微孔液體表面所有的泡沫（可以用移液管尖去除） －用ELISA reader 610～630nm（或540～550nm）條件下讀取渾濁度 注意： －當孵育44～48小時后，微孔板能在冰箱里最多儲存48小時，因此必須在這個時間段內測量混濁度 －為了避免由于假期或周末所產生的時間上的損失，微孔板能在60小時之后進行評估計算。推薦使用定時器在48小時之后關閉孵育器。 11.計算 推薦在計算結果時使用必發(fā)公司提供的配套軟件。 樣品稀釋倍數(shù)40已經(jīng)包括在標準曲線中（詳見質量保證書）。在下面的公式中，只需要考慮提取的進一步稀釋倍數(shù)和不同的樣品重量。 液體樣品（富含維生素的果汁、健康飲品） 從標準曲線上讀取的濃度×稀釋倍數(shù) 葉酸 ＝ ──────────────────── （μg/100ml） 樣品總量（ml） 固體樣品（谷物、嬰兒食品、面粉、面包、添加物） 從標準曲線上讀取的濃度×稀釋倍數(shù) 葉酸 ＝ ──────────────────── （μg/100g） 樣品總量（g） 膠囊或藥片 從標準曲線上讀取的濃度×稀釋倍數(shù) 葉酸 ＝ ──────────────────── （μg/100g） 樣品總量（g） 從標準曲線上讀取的濃度×藥片重量（g）×稀釋倍數(shù) 葉酸＝ ────────────────────────── （μg/藥片） 100×樣品總量（g） 樣品提取的稀釋倍數(shù)計算示例 例a： 固體樣品，標注濃度125μg / 100g 提取液稀釋應在標準曲線中間區(qū)域。因此，濃度應除以標準2 計算： 1.2 μg ÷ 0.32 μg ＝390 → 結果為稀釋倍數(shù)大約為400 → 1 ：400 稀釋 1 ： 400 1 ： 10（0.1 ml ＋ 0.9 ml）， 1 ： 10（0.1 ml ＋ 0.9 ml）， 1 ：4（0.25 ml ＋ 0.75 ml） 例b： 藥片，標注濃度100μg / 片 計算： 100 μg / 片，平均重量1g ＝ 10000μg / 100g 10000 μg ÷ 0.32 μg ＝31250 →結果為稀釋倍數(shù)大約為30000 →1 ：30000稀釋 1 ：30000 1 ：10（0.1 ml ＋ 0.9 ml），1 ：10（0.1 ml ＋ 0.9 ml） 1 ：10（0.1 ml ＋ 0.9 ml），1 ：10（0.1 ml ＋ 0.9 ml）， 1 ：3（0.2 ml ＋ 0.4 ml） |
3樓2012-11-20 01:42:23
| 馬 |
4樓2013-05-15 21:58:26
kenyang214
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