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liuchang_1鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
用試劑盒檢測(cè)奶粉中的葉酸
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| 各位大俠，請(qǐng)問下有誰使用過拜發(fā)試劑盒微生物法（96孔板）檢測(cè)奶粉中的葉酸，我們?cè)谑褂玫倪^程中重復(fù)性不好，在奶粉的前處理和使用酶標(biāo)儀測(cè)定菌的濃度時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線由于菌液的不均勻不斷變化，導(dǎo)致待測(cè)樣的濃度也會(huì)出現(xiàn)變化，具體應(yīng)該有個(gè)什么樣的標(biāo)準(zhǔn)呢？謝謝！ |
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lichao5263
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【答案】應(yīng)助回帖
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搜到的一篇文獻(xiàn)，用的不同方法，自己慢慢看吧！6個(gè)金幣，真小氣 Determination of folic acid in milk.pdf(133.14KB) http://kuai.xunlei.com/d/GLHWAFWYOIDQ?p=130497 |
2樓2012-11-20 01:33:02
lichao5263
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【答案】應(yīng)助回帖
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VitaFast® Folic Acid 簡(jiǎn)介 VitaFast® Folic Acid試劑盒簡(jiǎn)單易用，采用微生物方法，在微孔板中定量檢測(cè)食品、藥品和飼料中的葉酸總量（包括添加和原生葉酸）。所有所需的試劑均包含在試劑盒中。本試劑盒共能提供96次檢測(cè)（包括標(biāo)準(zhǔn)品）。最后使用ELISA reader (610 - 630 nm 或者540 - 550 nm)進(jìn)行讀數(shù)。 含添加葉酸的樣品處理： 液態(tài)樣品：無菌過濾和稀釋 固態(tài)樣品：均質(zhì)、提�。x心）、無菌過濾和稀釋 含原生葉酸的樣品處理： 固態(tài)樣品：均質(zhì)、酶化處理、提取、（離心）、無菌過濾和稀釋 所需時(shí)間：試驗(yàn)過程…………………….約10分鐘 計(jì)算………………………….2分鐘 孵育： 黑暗、37 °C條件下44－48小時(shí) 標(biāo)準(zhǔn)范圍：0.16 - 1.28 μg / 100 g (ml) 回收率： 90 - 105 % Intra-assay CV for standards: < 10 % Inter-assay CV for standards: < 10 % 1． 產(chǎn)品用途 VitaFast® Folic Acid微孔板檢測(cè)試劑盒是利用微生物方法，用于定量檢測(cè)食品、藥品和飼料中的葉酸總量（包括添加和原生葉酸）。本微生物檢測(cè)系統(tǒng)符合EN14131標(biāo)準(zhǔn)。 2． 檢測(cè)原理 葉酸是從樣品稀釋提取所獲得的。將稀釋了的提取物和葉酸檢測(cè)培養(yǎng)基加入包被有鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus (ATCC Nr. 7469)的微孔中。Lactobacillus rhamnosus的生長(zhǎng)狀況取決于葉酸的含量。添加葉酸作為標(biāo)準(zhǔn)或者作為樣品混合物，細(xì)菌會(huì)一直生長(zhǎng)直至葉酸被消耗殆盡。孵育條件應(yīng)為黑暗、37 °C條件下孵育44-48小時(shí)。細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)新陳代謝的強(qiáng)度和葉酸的含量形成關(guān)系并可以繪制稱標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后通過ELISA reader在610 - 630 nm (或者540 - 550 nm)讀取結(jié)果。 3. 檢測(cè)說明 水質(zhì)在整個(gè)測(cè)試過程中起著十分重要的作用。本試劑盒中帶有作為溶劑的無菌蒸餾水，用于重組、稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的提取。附加的蒸餾水在以上過程中都是必不可少的。 要求整個(gè)檢測(cè)過程中保持無菌操作。所使用的玻璃器皿保證無化學(xué)殘留物、清潔劑、化學(xué)物質(zhì)和微生物污染。因此，玻璃器皿使用前先用3 mol / l的鹽酸漂洗，然后再用蒸餾水250 °C (482 °F)條件下加熱1小時(shí)。在使用前回至室溫。 樣品制備和提取可以不用在無菌條件下進(jìn)行。樣品的過濾、稀釋與檢測(cè)前的準(zhǔn)備工作則與整個(gè)檢測(cè)過程一樣必須在無菌條件下進(jìn)行。 檢測(cè)的每一個(gè)步驟都需要校正。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品應(yīng)該進(jìn)行3次檢測(cè)（注意：官方標(biāo)準(zhǔn)中推薦3次檢測(cè)方法）。未知樣品應(yīng)該用2份提取物的稀釋液檢測(cè)（誤差應(yīng)該小于10%）。如果在更高的稀釋液中葉酸含量更多，則可能含抑制劑，比如重金屬或者抗生素。 4. 提供試劑 每個(gè)試劑盒中包含： 1 x 96孔微孔板，包被有 Lactobacillus rhamnosus (ATCC Nr. 7469) 3 x 無菌蒸餾水 (30 ml) ，用于準(zhǔn)備培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品提取稀釋液 3 x 葉酸培養(yǎng)基 (固體) 3 x 葉酸標(biāo)準(zhǔn)品 (固體) 3 x 葉酸緩沖液 (液體) 3 x 粘性箔 1 x 微孔板固定器 5. 需要試劑但試劑盒種不提供 −黑暗條件下的培養(yǎng)箱，37 °C (98.6 °F) −90 -100 °C (194 - 212 °F)水浴，或者高壓滅菌鍋 −ELISA reader 610 - 630 nm (540 - 550 nm) −pH 測(cè)量?jī)x −離心機(jī)，大約10000 x g −刻度移液槍 20 - 200 μl; 100 - 1000 μl −滅菌微量移液槍 tips 20 - 200 μl and 100 - 1000 μl −無菌燒瓶 1.5 - 2.0 ml −移液槍 5 or 10 ml −帶帽的無菌離心機(jī)管 (15 and 50 ml) −帶無菌注射器的0.2um無菌濾膜 −雙蒸水用于樣品提取(available at ifp) −濃縮NaOH −1 mol / l NaOH (0.4 g 溶解于100 ml水中) 檢測(cè)原生葉酸所需試劑 −胰液素(Sigma P1750) −磷酸(鹽)緩沖液(0.5 mol / ；0.1 % 抗壞血酸鹽)：溶解于1升水 7.8 g脫氫磷酸鈉二水化合物和1 g 抗壞血酸鈉, 校正pH值至7.2 6．用戶須知 −檢測(cè)培養(yǎng)基有可能刺激眼睛、皮膚和隔膜 −完成試驗(yàn)后須根據(jù)規(guī)章處理檢測(cè)儀器（如使用高壓滅菌鍋） 7．貯藏條件 試劑盒應(yīng)存放在2－8℃條件下 處理過的試劑（標(biāo)準(zhǔn)品、培養(yǎng)基）和葉酸緩沖液應(yīng)馬上使用，并在檢測(cè)后丟棄 將未使用的微孔板條放回原來的箔袋中，并與干燥劑一起重新封好，放在2－8℃溫度下。微孔板須防止受潮或受到其他污染。 請(qǐng)勿在試劑盒標(biāo)注的有效期之后使用。 8．試劑失效的跡象 空白的吸光度值大于標(biāo)準(zhǔn)品1 最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值小于0.6（630nm） 9．樣品處理 樣品必須儲(chǔ)存在4℃、避光條件下。 檢測(cè)富集營(yíng)養(yǎng)樣品中的游離葉酸時(shí)，熱水提取方法通常就足夠了。但是富集營(yíng)養(yǎng)的飲料可以在過濾之后直接使用。由于使用熱水提取，所以原生葉酸只能被部分檢測(cè)。對(duì)于檢測(cè)原生V B12總量，樣品應(yīng)進(jìn)行緩沖和用酶水化處理。 樣品提取時(shí)需要1g或1ml樣品溶解于40ml雙蒸水或提取溶液中。相當(dāng)于樣品的稀釋倍數(shù)為40，這個(gè)稀釋倍數(shù)已經(jīng)包括在標(biāo)準(zhǔn)曲線中。 樣品提取后需要進(jìn)一步稀釋。稀釋倍數(shù)取決于由標(biāo)準(zhǔn)曲線中間部分顯示的標(biāo)準(zhǔn)濃度，它由期望的成分除以標(biāo)準(zhǔn)曲線中間區(qū)域所顯示的標(biāo)準(zhǔn)品濃度獲得（詳見產(chǎn)品標(biāo)簽或認(rèn)證，每100g或100ml濃度）。至于涉及到膠囊或藥片時(shí)，濃度時(shí)常表達(dá)為“/片膠囊”，此時(shí)濃度必須轉(zhuǎn)化成“/100g”（詳見11.的計(jì)算示例）。這個(gè)稀釋倍數(shù)在計(jì)算結(jié)果的時(shí)候必須考慮。 樣品提取時(shí)使用無菌濾膜（0.2μm）進(jìn)行過濾，此時(shí)。如果由于固體顆粒或者渾濁導(dǎo)致過濾不順利，則在無菌過濾之前應(yīng)先離心（至少在8000g的離心力下離心5分鐘）。 樣品提取液可以在提取當(dāng)天使用，使用之前應(yīng)避光保存。提取稀釋液應(yīng)馬上使用。 9.1.液體樣品（富含維生素的果汁、健康飲品） 加入1ml樣品至50ml無菌離心管中，準(zhǔn)確加入雙蒸水至40ml，搖勻。使用無菌0.2μm濾紙過濾1.0～1.5ml樣品到一個(gè)無菌試管中。是否進(jìn)一步稀釋則取決于濃度范圍（詳見計(jì)算示例中的稀釋倍數(shù)）。 9.2.含維生素的可溶固體樣品（粉末、藥片） 稱取1g樣品至50ml無菌試管，用雙蒸水準(zhǔn)確加至30ml刻度。搖勻至樣品溶解。用NaOH調(diào)整pH值至7.0～7.5。然后加無菌水精確至40ml。用0.2μm無菌濾紙過濾1.0～1.5ml樣品至一無菌試管中。是否進(jìn)一步稀釋則取決于濃度范圍（詳見計(jì)算示例中的稀釋倍數(shù)）。 9.3.維生素膠囊、藥片 首先膠囊或藥片的重量必須確定（平均5～10個(gè)膠囊或藥片）。藥片用研缽或攪拌機(jī)均質(zhì)，膠囊須切開并取出其中的顆粒進(jìn)行試驗(yàn)。 稱取1g藥片或切開1個(gè)膠囊至一個(gè)50ml無菌離心管中，用雙蒸水加至30ml，搖勻。用NaOH調(diào)整pH值至7.0～7.5。然后加無菌水精確至40ml。在90～100℃水浴中提取30分鐘。在提取時(shí)試管須振蕩至少5次。當(dāng)然期間必須保證試管是否充分封閉。迅速降溫至30℃以下。使用0.2μm無菌濾膜過濾1.0～1.5ml樣品至一個(gè)無菌試管中。是否進(jìn)一步稀釋則取決于濃度范圍（詳見計(jì)算示例中的稀釋倍數(shù)）。 9.4富含維生素的谷物、嬰兒食品、面包、面粉和食品添加劑 稱量1g均質(zhì)過的樣品至一個(gè)50ml無菌試管中，加入雙蒸水至30ml，充分搖勻。用氫氧化鈉溶液調(diào)整其pH值至7.0-7.5，用雙蒸水加至40ml在90～100℃水浴中提取30分鐘。在提取時(shí)試管須振蕩至少5次。迅速冷卻至室溫。使用0.2μm無菌濾紙過濾1.0～1.5ml樣品至一個(gè)無菌試管中并進(jìn)行進(jìn)一步稀釋。 9.5.原生葉酸 提取復(fù)合物時(shí)，檢測(cè)含原生葉酸的樣品必須先經(jīng)過酶化處理。以下檢測(cè)過程已經(jīng)開始在檢測(cè)牛奶時(shí)使用。 稱取1g均質(zhì)過的樣品至一個(gè)50ml無菌離心管中，用磷酸鹽緩沖液加至40ml（0.05mol/l；0.1％抗壞血酸鹽；pH7.2）。之后在90～100℃水浴中提取30分鐘。在提取時(shí)試管須振蕩至少5次。冷卻至室溫，加入10mg干胰液素。旋緊管蓋，搖勻，在37℃條件下培養(yǎng)24小時(shí)。隨后在90～100℃水浴中提取30分鐘。迅速冷卻至室溫。使用0.2μm無菌濾紙過濾1.0～1.5ml樣品至一個(gè)無菌試管中。是否進(jìn)一步稀釋則取決于濃度范圍（詳見計(jì)算示例中的稀釋倍數(shù)）。 10.檢測(cè)過程 10.1.準(zhǔn)備 裝有無菌水的瓶子：推開藍(lán)色帽，沿著玻璃邊緣垂直向上拉開，丟棄。 葉酸培養(yǎng)基：足夠進(jìn)行至少6條微孔板試驗(yàn)，培養(yǎng)基必須在試驗(yàn)之前新鮮制備。打開瓶蓋用鑷子從干燥劑中取出培養(yǎng)基，丟掉干燥劑。 －加入10ml無菌水（取自試劑盒中）至葉酸培養(yǎng)基中。 －加入1ml葉酸緩沖液至培養(yǎng)基中。 －蓋好培養(yǎng)基瓶，搖勻。 －在90～100℃水浴中加熱至少5分鐘，期間振蕩至少2次；期間保證瓶子封閉。 －迅速冷卻至室溫（低于30℃）。 －使用0.2μm無菌濾紙過濾培養(yǎng)基至15ml無菌離心管中。 每個(gè)葉酸標(biāo)準(zhǔn)品都足夠進(jìn)行至少3個(gè)孔的試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)品必須在試驗(yàn)之前新鮮制備。 －打開維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品瓶，取出蓋子。丟掉蓋子和紅色塞子 －加入x ml（x＝詳見質(zhì)量保證書）無菌水（取自試劑盒）至標(biāo)準(zhǔn)品瓶中。用移液管溶解標(biāo)準(zhǔn)品：用標(biāo)準(zhǔn)品瓶中的水沖洗移液管尖數(shù)次＝標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液。 －取6個(gè)無菌管（1.5～2.0ml）并按照下列表格準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品溶液。 標(biāo)準(zhǔn)曲線 μg/100g(ml) 無菌水 μl 標(biāo)準(zhǔn)濃縮液 μl 總體積 μl 空白：0 900 ＋ 0 ＝ 900 標(biāo)準(zhǔn)品1：0.16 900 ＋ 100 ＝ 1000 標(biāo)準(zhǔn)品2：0.32 400 ＋ 100 ＝ 500 標(biāo)準(zhǔn)品3：0.64 300 ＋ 200 ＝ 500 標(biāo)準(zhǔn)品4：0.96 200 ＋ 300 ＝ 500 標(biāo)準(zhǔn)品5：1.28 100 ＋ 400 ＝ 500 10.2.檢測(cè)過程 －用移液管吸取150μl葉酸培養(yǎng)基至微孔中 －用移液管吸取150μl標(biāo)準(zhǔn)品或樣品至指定的微孔中（用標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液沖洗移液管尖） －用粘合箔蓋住微孔條或微孔：除去粘合箔上的保護(hù)層，將其平放在微孔條上，用手或壓舌板將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條。 注意：保證粘合箔和微孔的封閉性，特別注意微孔的邊緣部分 －在37℃黑暗條件下（可用孵育器）孵育44～48小時(shí) 10.3.測(cè)量 －再次向下擠壓粘合箔，將微孔板向上放置在桌面上，在桌面平面上振蕩，使微生物溶解在培養(yǎng)基中 －對(duì)角揭去粘合箔，從左邊開始進(jìn)行 －破壞微孔液體表面所有的泡沫（可以用移液管尖去除） －用ELISA reader 610～630nm（或540～550nm）條件下讀取渾濁度 注意： －當(dāng)孵育44～48小時(shí)后，微孔板能在冰箱里最多儲(chǔ)存48小時(shí)，因此必須在這個(gè)時(shí)間段內(nèi)測(cè)量混濁度 －為了避免由于假期或周末所產(chǎn)生的時(shí)間上的損失，微孔板能在60小時(shí)之后進(jìn)行評(píng)估計(jì)算。推薦使用定時(shí)器在48小時(shí)之后關(guān)閉孵育器。 11.計(jì)算 推薦在計(jì)算結(jié)果時(shí)使用必發(fā)公司提供的配套軟件。 樣品稀釋倍數(shù)40已經(jīng)包括在標(biāo)準(zhǔn)曲線中（詳見質(zhì)量保證書）。在下面的公式中，只需要考慮提取的進(jìn)一步稀釋倍數(shù)和不同的樣品重量。 液體樣品（富含維生素的果汁、健康飲品） 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取的濃度×稀釋倍數(shù) 葉酸 ＝ ──────────────────── （μg/100ml） 樣品總量（ml） 固體樣品（谷物、嬰兒食品、面粉、面包、添加物） 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取的濃度×稀釋倍數(shù) 葉酸 ＝ ──────────────────── （μg/100g） 樣品總量（g） 膠囊或藥片 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取的濃度×稀釋倍數(shù) 葉酸 ＝ ──────────────────── （μg/100g） 樣品總量（g） 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取的濃度×藥片重量（g）×稀釋倍數(shù) 葉酸＝ ────────────────────────── （μg/藥片） 100×樣品總量（g） 樣品提取的稀釋倍數(shù)計(jì)算示例 例a： 固體樣品，標(biāo)注濃度125μg / 100g 提取液稀釋應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線中間區(qū)域。因此，濃度應(yīng)除以標(biāo)準(zhǔn)2 計(jì)算： 1.2 μg ÷ 0.32 μg ＝390 → 結(jié)果為稀釋倍數(shù)大約為400 → 1 ：400 稀釋 1 ： 400 1 ： 10（0.1 ml ＋ 0.9 ml）， 1 ： 10（0.1 ml ＋ 0.9 ml）， 1 ：4（0.25 ml ＋ 0.75 ml） 例b： 藥片，標(biāo)注濃度100μg / 片 計(jì)算： 100 μg / 片，平均重量1g ＝ 10000μg / 100g 10000 μg ÷ 0.32 μg ＝31250 →結(jié)果為稀釋倍數(shù)大約為30000 →1 ：30000稀釋 1 ：30000 1 ：10（0.1 ml ＋ 0.9 ml），1 ：10（0.1 ml ＋ 0.9 ml） 1 ：10（0.1 ml ＋ 0.9 ml），1 ：10（0.1 ml ＋ 0.9 ml）， 1 ：3（0.2 ml ＋ 0.4 ml） |
3樓2012-11-20 01:42:23
| 馬 |
4樓2013-05-15 21:58:26
kenyang214
木蟲 (初入文壇)
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5樓2013-08-31 16:58:12
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[考研] 283求調(diào)劑 +3 | 聽風(fēng)就是雨； 2026-03-16 | 3/150 |
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[考研] 070303 總分349求調(diào)劑 +3 | LJY9966 2026-03-15 | 5/250 |
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[考研] 0856求調(diào)劑 +3 | 劉夢(mèng)微 2026-03-15 | 3/150 |
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[考研] 289求調(diào)劑 +4 | 這么名字咋樣 2026-03-14 | 6/300 |
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[考研] 求材料調(diào)劑 +5 | 隔壁陳先生 2026-03-12 | 5/250 |
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[考研] 315求調(diào)劑 +9 | 小羊小羊_ 2026-03-11 | 10/500 |
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[考研] 工科278分求調(diào)劑 +5 | 周慢熱啊 2026-03-12 | 7/350 |
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[考研] 工科材料085601 279求調(diào)劑 +8 | 困于星晨 2026-03-12 | 10/500 |
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[考博] 26讀博 +4 | Rui135246 2026-03-12 | 10/500 |
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