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chenzhenwei0銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于斑點(diǎn)檢測抗體來源，做免疫印跡做不下去了，會不會是一抗出問題了？
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我用的二抗是HRP標(biāo)記的兔抗牛，但是一抗最初說是牛源的，但是后來感覺不太可靠，實(shí)驗(yàn)怎么都沒有結(jié)果。目前通過試劑說明知道一抗可能是牛、兔、羊的，后來想到用DOT實(shí)驗(yàn)來檢測血清來源以進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，因此有買了二抗兔和羊的（由于一抗不好買其他的），但是經(jīng)過幾次的發(fā)現(xiàn)，羊的二抗有顯色反應(yīng)，但是也不很明顯, 以下是我的操作方法，請高手指教，謝謝了哈 第一步：將標(biāo)準(zhǔn)陽性血清分別滴于三小塊NC膜中央，使充分干燥,蛋白完全粘附與NC膜上，約1h。 第二步： 分別將膜放置于封閉盒中，用20ml含5%脫脂奶粉的PBST封閉1h，傾去封閉液，用PBST對膜稍作漂洗1次30s 第四步： 分別于膜中央滴加二抗辣根辛過氧化物標(biāo)記的兔抗牛、兔抗羊、羊抗兔40ul, 再用含1%脫脂奶粉的PBST進(jìn)行孵育1h,孵育二抗后用PBST潤洗三次。 第五步： 用小鑷子分別將膜從封閉盒取出，置于小平皿中，滴加臨時(shí)配制的DAB進(jìn)行顯色10min。 是不是操作有問題，感覺結(jié)果不理想啊 [ Last edited by 1949stone on 2011-9-6 at 10:41 ] |
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2樓2011-09-13 15:19:26
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w我看了你的步驟，你的應(yīng)該是正確的做法，。從你的結(jié)果來看，應(yīng)該是二抗結(jié)合一抗的能力很弱，所以造成顯色不明顯。另外也要考慮是不是顯示也有問題，如果是三種不同來源的二抗的話，理論上講，結(jié)合一抗的能力應(yīng)該是有所區(qū)別的，如果三個(gè)二抗都很弱的話，也可以換個(gè)顯色液試試 。不過你的做法還是很好的，很少有學(xué)生能想到這么做，贊一個(gè) |
5樓2012-03-03 17:45:47
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