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chenzhenwei0銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于斑點檢測抗體來源,做免疫印跡做不下去了,會不會是一抗出問題了?
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我用的二抗是HRP標(biāo)記的兔抗牛,但是一抗最初說是牛源的,但是后來感覺不太可靠,實驗怎么都沒有結(jié)果。目前通過試劑說明知道一抗可能是牛、兔、羊的,后來想到用DOT實驗來檢測血清來源以進一步實驗,因此有買了二抗兔和羊的(由于一抗不好買其他的),但是經(jīng)過幾次的發(fā)現(xiàn),羊的二抗有顯色反應(yīng),但是也不很明顯, 以下是我的操作方法,請高手指教,謝謝了哈 第一步:將標(biāo)準(zhǔn)陽性血清分別滴于三小塊NC膜中央,使充分干燥,蛋白完全粘附與NC膜上,約1h。 第二步: 分別將膜放置于封閉盒中,用20ml含5%脫脂奶粉的PBST封閉1h,傾去封閉液,用PBST對膜稍作漂洗1次30s 第四步: 分別于膜中央滴加二抗辣根辛過氧化物標(biāo)記的兔抗牛、兔抗羊、羊抗兔40ul, 再用含1%脫脂奶粉的PBST進行孵育1h,孵育二抗后用PBST潤洗三次。 第五步: 用小鑷子分別將膜從封閉盒取出,置于小平皿中,滴加臨時配制的DAB進行顯色10min。 是不是操作有問題,感覺結(jié)果不理想啊 [ Last edited by 1949stone on 2011-9-6 at 10:41 ] |
銅蟲 (小有名氣)
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