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引物二聚體會(huì)不會(huì)影響目的基因的遷移?
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如題 簡(jiǎn)單點(diǎn)說：切膠的時(shí)候 會(huì)不會(huì)你切300bp的條帶 實(shí)際上是350bp或250bp長(zhǎng)？ 或者 小片段會(huì)夾雜在大片段里 你切的大片段里最終還是存在有部分小片段？ 兩個(gè)疑問 大家暢所欲言吧 |
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曾秀鳳: 金幣+10, ★有幫助, 我們?cè)谟懻撜f 目的片段與引物二聚體可以分的很開的情況下 會(huì)不會(huì)有部分引物二聚體它纏在目的片段中間 不能通過切膠的方法去除引物二聚體的小片段？ 您覺得有這種可能不 2012-11-26 08:50:00
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曾秀鳳: 金幣+10, ★有幫助, 我們?cè)谟懻撜f 目的片段與引物二聚體可以分的很開的情況下 會(huì)不會(huì)有部分引物二聚體它纏在目的片段中間 不能通過切膠的方法去除引物二聚體的小片段？ 您覺得有這種可能不 2012-11-26 08:50:00
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會(huì)。如果maker不好的話，那個(gè)帶的位置就不對(duì)了 引物二聚體在跑膠時(shí)一般會(huì)在最下面，片段不會(huì)太大，100bp左右，如果你的目的片段小的話則有可能混在一起，但是片段大的話引物二聚體不會(huì)影響到 |
2樓2012-11-24 14:52:21
seanzhu1996
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3樓2012-11-24 15:12:44
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曾秀鳳: 金幣+10, ★★★很有幫助, 嗯 我們一般用2%的膠跑 大體能夠分開的 關(guān)鍵是我切膠后跑2100芯片發(fā)現(xiàn)居然切膠后回收的片段里面發(fā)現(xiàn)有小片段沒有出除干凈 2012-11-26 08:52:09
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曾秀鳳: 金幣+10, ★★★很有幫助, 嗯 我們一般用2%的膠跑 大體能夠分開的 關(guān)鍵是我切膠后跑2100芯片發(fā)現(xiàn)居然切膠后回收的片段里面發(fā)現(xiàn)有小片段沒有出除干凈 2012-11-26 08:52:09
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如果要回收小片段，可以用濃一點(diǎn)兒的凝膠跑產(chǎn)物，會(huì)好一些。有的時(shí)候兩個(gè)片段太近，確實(shí)很難分開。 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
5樓2012-11-24 18:47:59
yyk81
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曾秀鳳: 金幣+30, ★★★★★最佳答案, 我們也是EB后染的 所以應(yīng)該片段選擇比較精確 對(duì)吧 結(jié)果切膠回收后檢測(cè)還是會(huì)發(fā)現(xiàn)目的片段里有小片段的存在 所以很困惑 2012-11-26 08:54:12
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曾秀鳳: 金幣+30, ★★★★★最佳答案, 我們也是EB后染的 所以應(yīng)該片段選擇比較精確 對(duì)吧 結(jié)果切膠回收后檢測(cè)還是會(huì)發(fā)現(xiàn)目的片段里有小片段的存在 所以很困惑 2012-11-26 08:54:12
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你的問題應(yīng)該分3個(gè)層面回答。1，引物二聚體不影響目的產(chǎn)物的遷移。2，目的帶的大小想精確反映在膠上，電泳時(shí)不能加核酸染料，跑完膠后在再染色，跑出來(lái)是多大就是多大，不失真，不會(huì)出現(xiàn)250bp看起來(lái)像300bp的情況。3，如果想分開大小很接近兩條帶，需要提高分辨率，提高膠濃度是個(gè)好辦法。 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
6樓2012-11-25 08:11:25
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8樓2012-11-26 08:54:22
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9樓2012-11-27 08:49:27
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gyesang: 金幣+1, 鼓勵(lì)新人交流！ 2012-12-09 00:37:04
曾秀鳳: 金幣+10, ★★★★★最佳答案, 你分條說的很清楚了 謝謝啊 但是呢 我切膠前后都會(huì)在凝膠成像儀上拍下照片確定切下的一定是目的條帶 我們用2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖跑2-3h 就這樣 通過芯片檢測(cè) 還是會(huì)發(fā)現(xiàn)夾雜有小片段 呵呵 雖然對(duì)結(jié)果的影響不是很大 就只是覺得很奇怪于這種現(xiàn)象而已 2012-12-12 10:08:15
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曾秀鳳: 金幣+10, ★★★★★最佳答案, 你分條說的很清楚了 謝謝啊 但是呢 我切膠前后都會(huì)在凝膠成像儀上拍下照片確定切下的一定是目的條帶 我們用2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖跑2-3h 就這樣 通過芯片檢測(cè) 還是會(huì)發(fā)現(xiàn)夾雜有小片段 呵呵 雖然對(duì)結(jié)果的影響不是很大 就只是覺得很奇怪于這種現(xiàn)象而已 2012-12-12 10:08:15
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問題1：切膠的時(shí)候 會(huì)不會(huì)你切300bp的條帶 實(shí)際上是350bp或250bp長(zhǎng)？ 回答：這個(gè)是有可能的，即便你點(diǎn)的雙個(gè)marker, 但由于凝膠的問題或者電泳系統(tǒng)的問題亦或者marker本身精確度不高的問題，完全有可能出現(xiàn)這種情況。建議在切膠前，在成像系統(tǒng)上看一下再切，確定你的目的產(chǎn)物確實(shí)存在并確定目的條帶的位置，或者可以再UV板上看著切（這個(gè)要做好防護(hù)，建議還是在成像系統(tǒng)上看確定一下目的條帶就可以了）。 問題2：小片段會(huì)夾雜在大片段里 你切的大片段里最終還是存在有部分小片段？ 回答：這個(gè)也完全可能，特別是電泳時(shí)間不夠充分且存在于目的條帶大小相近的非特異性擴(kuò)增條帶的情況下極為容易出現(xiàn)相近大小的條帶沒有完全分開，或者切膠不夠精細(xì)也可能發(fā)生這樣的問題。 問題3：引物二聚體是否會(huì)影響目的基因遷移？ 回答：如果你的目的條帶是300bp這個(gè)不會(huì)，但是如果產(chǎn)物很小，小于100bp，就有可能。但是，一般普通PCR或Real-time PCR 都會(huì)建議你目的條帶大于100-150bp，所以引物二聚體不會(huì)影響目的基因遷移。但是也要優(yōu)化引物，盡量避免大量引物二聚體的產(chǎn)生，大量引物二聚體的產(chǎn)生會(huì)影響擴(kuò)增效率。 但愿這些答案對(duì)你有幫助。 |
10樓2012-12-08 21:20:49
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