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引物二聚體會不會影響目的基因的遷移?
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如題 簡單點(diǎn)說：切膠的時候 會不會你切300bp的條帶 實際上是350bp或250bp長？ 或者 小片段會夾雜在大片段里 你切的大片段里最終還是存在有部分小片段？ 兩個疑問 大家暢所欲言吧 |
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2樓2012-11-24 14:52:21
seanzhu1996
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3樓2012-11-24 15:12:44
fendouysys
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4樓2012-11-24 15:16:30
zhaodahe
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
曾秀鳳: 金幣+10, ★★★很有幫助, 嗯 我們一般用2%的膠跑 大體能夠分開的 關(guān)鍵是我切膠后跑2100芯片發(fā)現(xiàn)居然切膠后回收的片段里面發(fā)現(xiàn)有小片段沒有出除干凈 2012-11-26 08:52:09
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
曾秀鳳: 金幣+10, ★★★很有幫助, 嗯 我們一般用2%的膠跑 大體能夠分開的 關(guān)鍵是我切膠后跑2100芯片發(fā)現(xiàn)居然切膠后回收的片段里面發(fā)現(xiàn)有小片段沒有出除干凈 2012-11-26 08:52:09
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如果要回收小片段，可以用濃一點(diǎn)兒的凝膠跑產(chǎn)物，會好一些。有的時候兩個片段太近，確實很難分開。 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
5樓2012-11-24 18:47:59
yyk81
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
曾秀鳳: 金幣+30, ★★★★★最佳答案, 我們也是EB后染的 所以應(yīng)該片段選擇比較精確 對吧 結(jié)果切膠回收后檢測還是會發(fā)現(xiàn)目的片段里有小片段的存在 所以很困惑 2012-11-26 08:54:12
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曾秀鳳: 金幣+30, ★★★★★最佳答案, 我們也是EB后染的 所以應(yīng)該片段選擇比較精確 對吧 結(jié)果切膠回收后檢測還是會發(fā)現(xiàn)目的片段里有小片段的存在 所以很困惑 2012-11-26 08:54:12
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你的問題應(yīng)該分3個層面回答。1，引物二聚體不影響目的產(chǎn)物的遷移。2，目的帶的大小想精確反映在膠上，電泳時不能加核酸染料，跑完膠后在再染色，跑出來是多大就是多大，不失真，不會出現(xiàn)250bp看起來像300bp的情況。3，如果想分開大小很接近兩條帶，需要提高分辨率，提高膠濃度是個好辦法。 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
6樓2012-11-25 08:11:25
yyll1988
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7樓2012-11-25 20:16:37
8樓2012-11-26 08:54:22
zhengli123
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9樓2012-11-27 08:49:27
Hong_LP
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+1, 鼓勵新人交流！ 2012-12-09 00:37:04
曾秀鳳: 金幣+10, ★★★★★最佳答案, 你分條說的很清楚了 謝謝啊 但是呢 我切膠前后都會在凝膠成像儀上拍下照片確定切下的一定是目的條帶 我們用2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖跑2-3h 就這樣 通過芯片檢測 還是會發(fā)現(xiàn)夾雜有小片段 呵呵 雖然對結(jié)果的影響不是很大 就只是覺得很奇怪于這種現(xiàn)象而已 2012-12-12 10:08:15
gyesang: 金幣+1, 鼓勵新人交流！ 2012-12-09 00:37:04
曾秀鳳: 金幣+10, ★★★★★最佳答案, 你分條說的很清楚了 謝謝啊 但是呢 我切膠前后都會在凝膠成像儀上拍下照片確定切下的一定是目的條帶 我們用2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖跑2-3h 就這樣 通過芯片檢測 還是會發(fā)現(xiàn)夾雜有小片段 呵呵 雖然對結(jié)果的影響不是很大 就只是覺得很奇怪于這種現(xiàn)象而已 2012-12-12 10:08:15
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問題1：切膠的時候 會不會你切300bp的條帶 實際上是350bp或250bp長？ 回答：這個是有可能的，即便你點(diǎn)的雙個marker, 但由于凝膠的問題或者電泳系統(tǒng)的問題亦或者marker本身精確度不高的問題，完全有可能出現(xiàn)這種情況。建議在切膠前，在成像系統(tǒng)上看一下再切，確定你的目的產(chǎn)物確實存在并確定目的條帶的位置，或者可以再UV板上看著切（這個要做好防護(hù)，建議還是在成像系統(tǒng)上看確定一下目的條帶就可以了）。 問題2：小片段會夾雜在大片段里 你切的大片段里最終還是存在有部分小片段？ 回答：這個也完全可能，特別是電泳時間不夠充分且存在于目的條帶大小相近的非特異性擴(kuò)增條帶的情況下極為容易出現(xiàn)相近大小的條帶沒有完全分開，或者切膠不夠精細(xì)也可能發(fā)生這樣的問題。 問題3：引物二聚體是否會影響目的基因遷移？ 回答：如果你的目的條帶是300bp這個不會，但是如果產(chǎn)物很小，小于100bp，就有可能。但是，一般普通PCR或Real-time PCR 都會建議你目的條帶大于100-150bp，所以引物二聚體不會影響目的基因遷移。但是也要優(yōu)化引物，盡量避免大量引物二聚體的產(chǎn)生，大量引物二聚體的產(chǎn)生會影響擴(kuò)增效率。 但愿這些答案對你有幫助。 |
10樓2012-12-08 21:20:49
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