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混水小蟲金蟲 (小有名氣)
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[求助]
分步雙酶切
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對質(zhì)粒進(jìn)行Hind III 和Sal I雙酶切，因兩個酶切位點離的太近（中間10個bp），請問是否應(yīng)該采用分步酶切��？ 還有就是如果采用雙酶切，這兩個酶的酶切順序如何確定�。� 在第一次酶切后，是不是必須要進(jìn)行去磷酸化處理？看到之前的帖子上，說關(guān)于分步酶切中間的純化步驟中，很多同學(xué)都沒有說去磷酸化處理這個環(huán)節(jié)，是不是這一環(huán)節(jié)可以省略��？ 純化方法哪個較好些��？有些同學(xué)說是要電泳再割膠回收，有的說不電泳直接乙醇沉淀法回收，也有的人說不電泳直接加入溶膠buffer，開始回收！ 請熟知這一方面的大蝦給點幫助吧！ |
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4樓2012-11-29 22:41:57
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9樓2012-11-30 09:46:22
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10樓2012-11-30 09:54:33
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樓主，我?guī)湍悴榱艘幌�，一般載體的多克隆位點區(qū)域中，SalI與HindIII的識別位點差距都在15個bp以上，同時翻閱酶的說明書，查得一般10bp以上的雙酶切不存在同時雙切效率損失的問題，一般甚至4bp以上的距離都能保持50%以上的酶切效率，大部分切不開的都是2bp以內(nèi)滴。 然后是酶切中就應(yīng)該同時加上去磷酸化酶，保證所有切口都應(yīng)該去磷酸話（這對于防止質(zhì)粒自連至關(guān)重要  ，俺們實驗室這么多年的分子實驗傳統(tǒng)，大部分假陽性都來源于沒有去磷酸�。� |
13樓2012-11-30 10:16:57
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