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pumpkin236鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于蛋白質(zhì)銀染的問題請教
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最近做了銀染 結(jié)果不好 有沒有懂的朋友幫忙看下 怎么改進 讓結(jié)果更清楚 下面是染色結(jié)果：發(fā)現(xiàn)最后顯色的時候 上部分高分子量蛋白質(zhì)很密集 一下子條帶就很深 下面小分子很淺 等下面部分小分子量條帶出來了以后吧 上面顏色深的看不見了 不知道怎么改進 左邊兩個條帶是marker，接著兩個是銀染的marker（條帶不知道為什么沒有顯示出來），接著是樣品，膠用的10%，用的pierce的銀染kit。 懂的朋友希望給一些改進意見。 DSC_0468.jpg(1.81MB) http://kuai.xunlei.com/d/LnU4DdoOiRTuUAQA7fb?p=130497 |
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cicelyzh
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pumpkin236: 金幣+2 2013-01-11 01:19:06
| 感覺你的樣品沒有制好似的。泳道內(nèi)有縱向拖尾。洗玻璃板時最后要用mili-q潤洗。不知道你做的什么樣品，是否在小分子量區(qū)的蛋白比較少。一般的樣品也有這種趨勢，蛋白在一定分子量區(qū)會比較密集。如果想讓膠上下均勻一點，可以做梯度膠試試。此外，銀染很靈敏，不知道你的上樣量是多少ug蛋白，跑的是多大的膠。沒有用kit銀染過，不知道是不是kit的問題。說實話啊，我不喜歡pierce的東西。 |
3樓2013-01-10 11:18:23
pumpkin236
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5樓2013-01-11 08:30:05
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我又用這個樣品重復(fù)了一次，縱向拖尾特別嚴(yán)重，w也感覺樣品處理的不好。你能告訴我詳細的樣品處理的方法么？ 我先說下 平時怎么處理的： 1 離心收集細胞（收集前會用pbs洗一次） 2 加裂解夜（sigma），我是纖維細胞，所以10cm 皿的細胞我一般只加50-80ul的裂解夜，怕加多了蛋白濃度低，但是每次濃度也只有1-2ug／ul。裂解15min，然后13000g 15min 離心 3 收集上清，上清中加入上樣緩沖液和2-巰基乙醇。比列是65%：25%：10% 4 90 度 5min 我需要加上樣buffer的時候再加1%sds否，我感覺樣品沒溶解好 謝謝 |
6樓2013-01-12 00:56:09
cicelyzh
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7樓2013-01-12 06:34:53
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