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dfl204鐵桿木蟲 (著名寫手)
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[求助]
BAC克隆相關(guān)問題請教
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1. 找別的課題組拿了一個BAC的質(zhì)粒DNA，氯霉素抗性，外源片段180kb左右。想轉(zhuǎn)到大腸桿菌中擴繁，但是36小時才有克隆，菌落和質(zhì)粒PCR均為陰性，一般這種情況正常長出克隆需要多長時間？如何提高轉(zhuǎn)化效率？ Ps： 感受態(tài)細胞是商業(yè)化的，熱激轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化的都試過。 2. 如果在此BAC基礎上想酶切后回收30-50kb左右的片段，如果沒有脈沖電泳儀，有什么好的方法可以完成。有人建議蔗糖梯度離心，但是沒有找到相應的純化特定大小DNA的方法，純化蛋白質(zhì)的倒是有很多。 有哪位賜教相應的詳細步驟？ 不甚感激！ |
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dshlove
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3樓2013-01-16 14:39:57
dshlove
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【答案】應助回帖
★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
dfl204: 金幣+2, ★★★很有幫助, 謝謝，如你所說，還有一些細節(jié)需要再多注意一點。 2013-01-16 12:18:35
感謝參與，應助指數(shù) +1
dfl204: 金幣+2, ★★★很有幫助, 謝謝，如你所說，還有一些細節(jié)需要再多注意一點。 2013-01-16 12:18:35
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個人建議 大腸桿菌一般過夜就能長出克隆，如果你的感受態(tài)沒有問題的話。 轉(zhuǎn)化效率的影響最大的兩個因素就是質(zhì)粒濃度和感受態(tài)。商業(yè)化感受態(tài)批次不同有時候轉(zhuǎn)化差很多，這得注意。 還有就是質(zhì)粒的純度和轉(zhuǎn)化加入的量的問題了，一般1ng的DNA就能飽和50ul的感受態(tài)的。 至于大質(zhì)粒酶切回收小片段，我沒成功過。不能瞎說。 能幫到就這么多了…… |
2樓2013-01-16 10:58:51
4樓2013-07-15 17:12:22
dfl204
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5樓2013-07-15 18:41:18
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