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克隆做不出來(lái)，求幫助
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做克隆一個(gè)月了，始終有兩個(gè)做不出來(lái)。都是大約2000bp的長(zhǎng)度。 1.載體：pFASTbac-gp67 感受態(tài)：DH5a 用BamHI和XhoI雙酶切 酶切37度，4小時(shí) 連接有時(shí)候過(guò)夜連，菌落很少，而且菌液pcr P不出來(lái)。 2.載體：pFASTbac-Hem 感受態(tài)：DH5a 用BglII和XhoI雙酶切 酶切37度，4小時(shí) 連接有時(shí)候過(guò)夜連，菌落很少，而且菌液pcr P不出來(lái) 酶切體系：回收片段43ul 酶1.2各1ul buffer 5ul BSA 0.5ul 連接體系：回收酶切產(chǎn)物 12ul T4連接酶1ul buffer 1.5ul 載體 0.5ul |
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raindick1231
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2樓2013-01-23 19:56:24
raindick1231
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3樓2013-01-23 20:08:21
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+3, 果然是專家 2013-01-29 08:35:44
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kx444555: 金幣+3, 果然是專家 2013-01-29 08:35:44
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克隆時(shí)一般需要設(shè)置一個(gè)載體自連對(duì)照，用于分析載體本身是否酶切完全。 還需要明確感受態(tài)細(xì)胞是否正常。 如果載體或外源片段酶切不完全，也會(huì)導(dǎo)致克隆失敗，建議你用double digestion designer設(shè)計(jì)雙酶切，以確保載體和你的目的基因片段酶切完全，提高克隆效率，減少假陽(yáng)性背景克隆。 如果都正常，那就要考慮是否克隆的基因?qū)Υ竽c桿菌有毒性（基因水平或蛋白質(zhì)水平）。由于毒性的原因，對(duì)導(dǎo)致很多基因在原核表達(dá)載體上克隆不成功。 祝好運(yùn)！ |
4樓2013-01-23 22:01:09
5樓2013-01-24 13:45:12
6樓2013-01-24 13:46:27
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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7樓2013-01-24 15:27:35
8樓2013-01-24 15:44:06
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