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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 克隆做不出來，求幫助
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[求助]
克隆做不出來，求幫助
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做克隆一個月了，始終有兩個做不出來。都是大約2000bp的長度。 1.載體：pFASTbac-gp67 感受態(tài)：DH5a 用BamHI和XhoI雙酶切 酶切37度，4小時 連接有時候過夜連，菌落很少，而且菌液pcr P不出來。 2.載體：pFASTbac-Hem 感受態(tài)：DH5a 用BglII和XhoI雙酶切 酶切37度，4小時 連接有時候過夜連，菌落很少，而且菌液pcr P不出來 酶切體系：回收片段43ul 酶1.2各1ul buffer 5ul BSA 0.5ul 連接體系：回收酶切產(chǎn)物 12ul T4連接酶1ul buffer 1.5ul 載體 0.5ul |
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9樓2013-01-24 17:26:10
raindick1231
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2樓2013-01-23 19:56:24
raindick1231
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3樓2013-01-23 20:08:21
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+3, 果然是專家 2013-01-29 08:35:44
感謝參與，應助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+3, 果然是專家 2013-01-29 08:35:44
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克隆時一般需要設置一個載體自連對照，用于分析載體本身是否酶切完全。 還需要明確感受態(tài)細胞是否正常。 如果載體或外源片段酶切不完全，也會導致克隆失敗，建議你用double digestion designer設計雙酶切，以確保載體和你的目的基因片段酶切完全，提高克隆效率，減少假陽性背景克隆。 如果都正常，那就要考慮是否克隆的基因對大腸桿菌有毒性（基因水平或蛋白質水平）。由于毒性的原因，對導致很多基因在原核表達載體上克隆不成功。 祝好運！ |
4樓2013-01-23 22:01:09
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