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shiliyusly新蟲 (小有名氣)
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[求助]
QPCR
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 想請教下高手，進行熒光定量PCR進行測定基因表達豐度的相對值的一般步驟是什么呢？我之前用QPCR的基因先用普通PCR摸索最佳退火溫度，然后再進行SYBR 染料QPCR，這兩種PCR的酶是不同的。 通過看溶解曲線發(fā)現(xiàn)普通PCR摸索的退火溫度用于QPCR并不是最佳的，所以還得用QPCR重新摸索，實在麻煩，還有些會有弱弱的小峰（下面兩個溶解曲線可用嗎），那就要做濃度梯度做擴增效率了嗎？覺得實在是麻煩啊，有點想偷懶了。。。麻煩高手指點下，非常感謝�。。。。。。。。。。。。。。� ACT比較.jpg |
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不知道你怎樣得到這種想法的。在我看來，如果擴增出來的產(chǎn)物不單一的引物不能用做定量。因為定量的時候測的是熒光。如果除了目的產(chǎn)物之外有其它東西也會發(fā)出熒光，讀出的CT是不準(zhǔn)確的。 你說如果不是最優(yōu)的話大家都不是最優(yōu)也有問題的。不能小看這個小峰的。你會發(fā)現(xiàn)目標(biāo)mRNA豐度高的樣品小峰相對會比較低，對那些豐度低的樣品非特異擴增和引物二聚體的峰會更明顯。 我建議你多設(shè)計幾對引物，選一對最好的做實驗。 |
12樓2013-01-23 14:36:33
mamadexiao
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2樓2013-01-22 22:10:43
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3樓2013-01-22 22:36:37
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4樓2013-01-22 22:40:37
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