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shiliyusly新蟲 (小有名氣)
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[求助]
QPCR
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 想請教下高手，進(jìn)行熒光定量PCR進(jìn)行測定基因表達(dá)豐度的相對值的一般步驟是什么呢？我之前用QPCR的基因先用普通PCR摸索最佳退火溫度，然后再進(jìn)行SYBR 染料QPCR，這兩種PCR的酶是不同的。 通過看溶解曲線發(fā)現(xiàn)普通PCR摸索的退火溫度用于QPCR并不是最佳的，所以還得用QPCR重新摸索，實(shí)在麻煩，還有些會有弱弱的小峰（下面兩個(gè)溶解曲線可用嗎），那就要做濃度梯度做擴(kuò)增效率了嗎？覺得實(shí)在是麻煩啊，有點(diǎn)想偷懶了。。。麻煩高手指點(diǎn)下，非常感謝�。。。。。。。。。。。。。�！ ACT比較.jpg |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 | 【分子生物】EPI帖 | PCR問題集錦 |
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摸引物條件的時(shí)候要求你最后去跑個(gè)膠，看下你的引物在不同退火溫度下的條帶是不是單一可用地，大小是否符合你設(shè)計(jì)的產(chǎn)物大小。 再說你的這溶解曲線，你是覺得第一張最前面有個(gè)小峰，但實(shí)際上，如果P出來的是單一目的條帶，應(yīng)該兩個(gè)溫度影響不大 但是，還有一個(gè)問題，就是你分析數(shù)據(jù)的時(shí)候，其實(shí)看的是起峰的初始Ct值，跟后面的無關(guān)的。 |
2樓2013-01-22 22:10:43
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3樓2013-01-22 22:36:37
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4樓2013-01-22 22:40:37
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如果熔解曲線中出現(xiàn)不同的峰說明產(chǎn)物不單一。跑膠的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)比不上熒光定量的檢測線，膠上一條帶不能說明沒有非特異擴(kuò)增和引物二聚體的存在。你圖上所說的小峰在定量時(shí)肯定會影響結(jié)果的。你可以檢測一下擴(kuò)增效率，出現(xiàn)其他峰的反應(yīng)的擴(kuò)增效率會偏高，讀出的CT值偏小。引物的擴(kuò)增效率是要做的，否則你用來計(jì)算2^(-ΔΔCT)的根據(jù)在哪里呢？出現(xiàn)其他峰是和引物設(shè)計(jì)有關(guān)的�？赡苁且锾禺愋圆罨蚴切纬啥垠w。 對于退火溫度的優(yōu)化，是要用qPCR的體系的。你也發(fā)現(xiàn)了，不同體系得到的最優(yōu)溫度也是不同的。不過可以先用普通PCR檢測一下引物是否能P出目的條帶，掌握大致的退火溫度。 做熒光定量不能怕麻煩，各種條件控制好才能得到可信度高的數(shù)據(jù)。 |
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shiliyusly5樓2013-01-23 08:26:06
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6樓2013-01-23 08:28:04
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8樓2013-01-23 09:44:10
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| 我們一般都不用普通PCR摸索一下退火溫度，用的是Taq酶，然后再上qRT-PCR，按照一般標(biāo)準(zhǔn)，20ul體系，SYBR染料，溶解曲線不是一個(gè)峰的話，說明有引物二聚體，我認(rèn)為只要普通PCR做的時(shí)候沒有引物二聚體，qRT-PCR也不會有的，反正我都是這樣做的，結(jié)果都挺好的。。。 |
9樓2013-01-23 10:56:02
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