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shiliyusly新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
QPCR
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 想請(qǐng)教下高手，進(jìn)行熒光定量PCR進(jìn)行測(cè)定基因表達(dá)豐度的相對(duì)值的一般步驟是什么呢？我之前用QPCR的基因先用普通PCR摸索最佳退火溫度，然后再進(jìn)行SYBR 染料QPCR，這兩種PCR的酶是不同的。 通過(guò)看溶解曲線發(fā)現(xiàn)普通PCR摸索的退火溫度用于QPCR并不是最佳的，所以還得用QPCR重新摸索，實(shí)在麻煩，還有些會(huì)有弱弱的小峰（下面兩個(gè)溶解曲線可用嗎），那就要做濃度梯度做擴(kuò)增效率了嗎？覺(jué)得實(shí)在是麻煩啊，有點(diǎn)想偷懶了。。。麻煩高手指點(diǎn)下，非常感謝�。。。。。。。。。。。。。�！ ACT比較.jpg |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-01-23 16:11:45
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小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-01-23 16:11:45
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如果熔解曲線中出現(xiàn)不同的峰說(shuō)明產(chǎn)物不單一。跑膠的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)比不上熒光定量的檢測(cè)線，膠上一條帶不能說(shuō)明沒(méi)有非特異擴(kuò)增和引物二聚體的存在。你圖上所說(shuō)的小峰在定量時(shí)肯定會(huì)影響結(jié)果的。你可以檢測(cè)一下擴(kuò)增效率，出現(xiàn)其他峰的反應(yīng)的擴(kuò)增效率會(huì)偏高，讀出的CT值偏小。引物的擴(kuò)增效率是要做的，否則你用來(lái)計(jì)算2^(-ΔΔCT)的根據(jù)在哪里呢？出現(xiàn)其他峰是和引物設(shè)計(jì)有關(guān)的。可能是引物特異性差或是形成二聚體。 對(duì)于退火溫度的優(yōu)化，是要用qPCR的體系的。你也發(fā)現(xiàn)了，不同體系得到的最優(yōu)溫度也是不同的。不過(guò)可以先用普通PCR檢測(cè)一下引物是否能P出目的條帶，掌握大致的退火溫度。 做熒光定量不能怕麻煩，各種條件控制好才能得到可信度高的數(shù)據(jù)。 |
shiliyusly5樓2013-01-23 08:26:06
mamadexiao
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-01-23 16:11:19
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-01-23 16:11:19
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摸引物條件的時(shí)候要求你最后去跑個(gè)膠，看下你的引物在不同退火溫度下的條帶是不是單一可用地，大小是否符合你設(shè)計(jì)的產(chǎn)物大小。 再說(shuō)你的這溶解曲線，你是覺(jué)得第一張最前面有個(gè)小峰，但實(shí)際上，如果P出來(lái)的是單一目的條帶，應(yīng)該兩個(gè)溫度影響不大 但是，還有一個(gè)問(wèn)題，就是你分析數(shù)據(jù)的時(shí)候，其實(shí)看的是起峰的初始Ct值，跟后面的無(wú)關(guān)的。 |
2樓2013-01-22 22:10:43
shiliyusly
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3樓2013-01-22 22:36:37
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4樓2013-01-22 22:40:37
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