 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 1875 | 回復(fù): 13 | |||||
| 本帖產(chǎn)生 1 個(gè) MolEPI ，點(diǎn)擊這里進(jìn)行查看 | |||||
shiliyusly新蟲(chóng) (小有名氣)
|
[求助]
QPCR
|
||||
 想請(qǐng)教下高手，進(jìn)行熒光定量PCR進(jìn)行測(cè)定基因表達(dá)豐度的相對(duì)值的一般步驟是什么呢？我之前用QPCR的基因先用普通PCR摸索最佳退火溫度，然后再進(jìn)行SYBR 染料QPCR，這兩種PCR的酶是不同的。 通過(guò)看溶解曲線發(fā)現(xiàn)普通PCR摸索的退火溫度用于QPCR并不是最佳的，所以還得用QPCR重新摸索，實(shí)在麻煩，還有些會(huì)有弱弱的小峰（下面兩個(gè)溶解曲線可用嗎），那就要做濃度梯度做擴(kuò)增效率了嗎？覺(jué)得實(shí)在是麻煩啊，有點(diǎn)想偷懶了。。。麻煩高手指點(diǎn)下，非常感謝�。。。。。。。。。。。。。�！ ACT比較.jpg |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專(zhuān)輯推薦
 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 | 【分子生物】EPI帖 | PCR問(wèn)題集錦 |
» 猜你喜歡
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有174人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專(zhuān)業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有15人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
cicelyzh
鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
- MolEPI: 10
- 應(yīng)助: 1662 (講師)
- 金幣: 8693.8
- 紅花: 72
- 帖子: 3516
- 在線: 456小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1614001
- 注冊(cè): 2012-02-13
- 專(zhuān)業(yè): 生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-01-23 16:11:45
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+5, MolEPI+1, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-01-23 16:11:45
|
如果熔解曲線中出現(xiàn)不同的峰說(shuō)明產(chǎn)物不單一。跑膠的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)比不上熒光定量的檢測(cè)線，膠上一條帶不能說(shuō)明沒(méi)有非特異擴(kuò)增和引物二聚體的存在。你圖上所說(shuō)的小峰在定量時(shí)肯定會(huì)影響結(jié)果的。你可以檢測(cè)一下擴(kuò)增效率，出現(xiàn)其他峰的反應(yīng)的擴(kuò)增效率會(huì)偏高，讀出的CT值偏小。引物的擴(kuò)增效率是要做的，否則你用來(lái)計(jì)算2^(-ΔΔCT)的根據(jù)在哪里呢？出現(xiàn)其他峰是和引物設(shè)計(jì)有關(guān)的�？赡苁且锾禺愋圆罨蚴切纬啥垠w。 對(duì)于退火溫度的優(yōu)化，是要用qPCR的體系的。你也發(fā)現(xiàn)了，不同體系得到的最優(yōu)溫度也是不同的。不過(guò)可以先用普通PCR檢測(cè)一下引物是否能P出目的條帶，掌握大致的退火溫度。 做熒光定量不能怕麻煩，各種條件控制好才能得到可信度高的數(shù)據(jù)。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
shiliyusly5樓2013-01-23 08:26:06
mamadexiao
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- MolEPI: 2
- 應(yīng)助: 53 (初中生)
- 金幣: 5603.5
- 散金: 100
- 紅花: 7
- 帖子: 418
- 在線: 78.8小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 576831
- 注冊(cè): 2008-06-21
- 性別: MM
- 專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-01-23 16:11:19
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-01-23 16:11:19
|
摸引物條件的時(shí)候要求你最后去跑個(gè)膠，看下你的引物在不同退火溫度下的條帶是不是單一可用地，大小是否符合你設(shè)計(jì)的產(chǎn)物大小。 再說(shuō)你的這溶解曲線，你是覺(jué)得第一張最前面有個(gè)小峰，但實(shí)際上，如果P出來(lái)的是單一目的條帶，應(yīng)該兩個(gè)溫度影響不大 但是，還有一個(gè)問(wèn)題，就是你分析數(shù)據(jù)的時(shí)候，其實(shí)看的是起峰的初始Ct值，跟后面的無(wú)關(guān)的。 |
2樓2013-01-22 22:10:43
shiliyusly
新蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 265.4
- 散金: 17
- 紅花: 1
- 帖子: 138
- 在線: 71.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1434769
- 注冊(cè): 2011-10-10
- 專(zhuān)業(yè): 食品科學(xué)基礎(chǔ)
3樓2013-01-22 22:36:37
shiliyusly
新蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 265.4
- 散金: 17
- 紅花: 1
- 帖子: 138
- 在線: 71.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1434769
- 注冊(cè): 2011-10-10
- 專(zhuān)業(yè): 食品科學(xué)基礎(chǔ)
4樓2013-01-22 22:40:37
匿名
用戶注銷(xiāo) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 12 (小學(xué)生)
- 金幣: 766.4
- 帖子: 84
- 在線: 86.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 0
- 注冊(cè): 2012-04-11
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 基因表達(dá)調(diào)控與表觀遺傳學(xué)
★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
shiliyusly: 金幣+2, ★有幫助 2013-01-23 09:42:20
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-01-23 16:11:55
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
shiliyusly: 金幣+2, ★有幫助 2013-01-23 09:42:20
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-01-23 16:11:55
 本帖僅樓主可見(jiàn) |
6樓2013-01-23 08:28:04
shiliyusly
新蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 265.4
- 散金: 17
- 紅花: 1
- 帖子: 138
- 在線: 71.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1434769
- 注冊(cè): 2011-10-10
- 專(zhuān)業(yè): 食品科學(xué)基礎(chǔ)
7樓2013-01-23 09:42:08
匿名
用戶注銷(xiāo) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 12 (小學(xué)生)
- 金幣: 766.4
- 帖子: 84
- 在線: 86.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 0
- 注冊(cè): 2012-04-11
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 基因表達(dá)調(diào)控與表觀遺傳學(xué)
8樓2013-01-23 09:44:10
zhlf1989513
金蟲(chóng) (小有名氣)
- MolEPI: 2
- 應(yīng)助: 62 (初中生)
- 金幣: 1806.2
- 紅花: 2
- 帖子: 252
- 在線: 257.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1794702
- 注冊(cè): 2012-05-04
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 系統(tǒng)生物學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
shiliyusly: 金幣+1, ★有幫助 2013-01-23 11:08:55
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-01-23 16:12:03
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
shiliyusly: 金幣+1, ★有幫助 2013-01-23 11:08:55
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-01-23 16:12:03
| 我們一般都不用普通PCR摸索一下退火溫度，用的是Taq酶，然后再上qRT-PCR，按照一般標(biāo)準(zhǔn)，20ul體系，SYBR染料，溶解曲線不是一個(gè)峰的話，說(shuō)明有引物二聚體，我認(rèn)為只要普通PCR做的時(shí)候沒(méi)有引物二聚體，qRT-PCR也不會(huì)有的，反正我都是這樣做的，結(jié)果都挺好的。。。 |
9樓2013-01-23 10:56:02
shiliyusly
新蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 265.4
- 散金: 17
- 紅花: 1
- 帖子: 138
- 在線: 71.5小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1434769
- 注冊(cè): 2011-10-10
- 專(zhuān)業(yè): 食品科學(xué)基礎(chǔ)
10樓2013-01-23 11:03:12
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 shiliyusly 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 張芳銘-中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)-環(huán)境工程專(zhuān)碩-298 +3 | 手機(jī)用戶 2026-03-26 | 3/150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 070300化學(xué)求調(diào)劑 +4 | 起個(gè)名咋這么難 2026-03-27 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 285求調(diào)劑 +4 | AZMK 2026-03-27 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 【求調(diào)劑】085601材料工程專(zhuān)碩 | 總分272 | +4 | 腳滑的守法公民 2026-03-27 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 考研調(diào)劑 +4 | Sanmu-124 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 化學(xué)308分求調(diào)劑 +8 | 你好明天你好 2026-03-23 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +6 | 嗯嗯嗯嗯2 2026-03-27 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | 劉柯@ 2026-03-24 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿鄭大085600，310分求調(diào)劑 +5 | 李瀟可 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)一志愿南京師范大學(xué)303求調(diào)劑 +3 | zzffylgg 2026-03-24 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料學(xué)碩333求調(diào)劑 +8 | 北道巷 2026-03-24 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 359求調(diào)劑 +4 | 王了個(gè)楠 2026-03-25 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 317求調(diào)劑 +7 | 蛋黃咸肉粽 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +3 | 亞克西good 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 271求調(diào)劑 +6 | 生如夏花… 2026-03-22 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 086000生物與醫(yī)藥292求調(diào)劑 +6 | 小小陳小小 2026-03-22 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 306求0703調(diào)劑一志愿華中師范 +10 | 紙魚(yú)ly 2026-03-21 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 328求調(diào)劑 +4 | LHHL66 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求老師收我 +3 | zzh16938784 2026-03-23 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 考研調(diào)劑 +3 | 呼呼？~+123456 2026-03-21 | 3/150 |
|