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shiliyusly新蟲 (小有名氣)
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[求助]
QPCR
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 想請教下高手，進行熒光定量PCR進行測定基因表達豐度的相對值的一般步驟是什么呢？我之前用QPCR的基因先用普通PCR摸索最佳退火溫度，然后再進行SYBR 染料QPCR，這兩種PCR的酶是不同的。 通過看溶解曲線發(fā)現(xiàn)普通PCR摸索的退火溫度用于QPCR并不是最佳的，所以還得用QPCR重新摸索，實在麻煩，還有些會有弱弱的小峰（下面兩個溶解曲線可用嗎），那就要做濃度梯度做擴增效率了嗎？覺得實在是麻煩啊，有點想偷懶了。。。麻煩高手指點下，非常感謝�。。。。。。。。。。。。。。� ACT比較.jpg |
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如果熔解曲線中出現(xiàn)不同的峰說明產(chǎn)物不單一。跑膠的靈敏度遠遠比不上熒光定量的檢測線，膠上一條帶不能說明沒有非特異擴增和引物二聚體的存在。你圖上所說的小峰在定量時肯定會影響結(jié)果的。你可以檢測一下擴增效率，出現(xiàn)其他峰的反應(yīng)的擴增效率會偏高，讀出的CT值偏小。引物的擴增效率是要做的，否則你用來計算2^(-ΔΔCT)的根據(jù)在哪里呢？出現(xiàn)其他峰是和引物設(shè)計有關(guān)的。可能是引物特異性差或是形成二聚體。 對于退火溫度的優(yōu)化，是要用qPCR的體系的。你也發(fā)現(xiàn)了，不同體系得到的最優(yōu)溫度也是不同的。不過可以先用普通PCR檢測一下引物是否能P出目的條帶，掌握大致的退火溫度。 做熒光定量不能怕麻煩，各種條件控制好才能得到可信度高的數(shù)據(jù)。 |
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shiliyusly5樓2013-01-23 08:26:06
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