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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » rt-qpcr標準曲線問題
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gaoyu_1984金蟲 (小有名氣)
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[求助]
rt-qpcr標準曲線問題
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大家好，最近在做rt-qpcr，用了很久的標曲RNA樣品(最高濃度約為90ng/uL，稀釋5個梯度)，兩周之前一切正常，慢慢就開始最低那個濃度梯度不能擴增，后來迅速發(fā)展為倒數(shù)第二個也不能擴增。標曲只剩下了3個點。以為是RNA降解了，于是重新制作了標樣，濃度約為300ng/uL，可最低兩個濃度還是不能正確有效擴增，前面三個濃度CT分別約為（18.75，20.74, 24.54） 于是又考慮probe,primer，RNase free water污染等原因，重新取了primer和probe stock（開封半年，-30度保存），還是一樣。然后又用了新kit，全部使用了帶濾膜的槍頭，可還是一樣。 kit: platimum quantitative rt-pcr thermoscript one-step system (invitrogen) 還請明白人指點一下那里可能出了問題。 |
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wqj1988926
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8樓2013-01-29 10:14:05
wqj1988926
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我個人不太理解樓主的實驗，我說下我個人做這方面實驗的過程，希望有參考價值。 1. 采用絕對定量的方法的時候，做標曲所采用的是標準品質粒，10倍濃度稀釋 2. 相對定量的時候做標曲所采用的標準品是反轉錄而成的cDNA，也是同樣稀釋。 樓主所采用的RNA來做標曲，理論上也是可以的，但操作不好的話可能真的會講解。 |
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gaoyu_19842樓2013-01-28 16:40:23
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rna濃度越低越容易降解，這是一方面 另一方面認真回憶回憶你的實驗操作步驟，和第一次成功的那次比對下 |
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3樓2013-01-28 17:33:58
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