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qinhuan0425新蟲 (初入文壇)
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[求助]
原核蛋白表達幾個疑問
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最近本人在做蛋白原核表達，有些疑問一直沒弄明白！ 1.IPTG誘導(dǎo)蛋白后，什么情況是直接加裂解液離心后加上樣緩沖液跑SDS-PAGE？什么情況需要超聲后離心跑電泳呢？ 2.尿素是什么時候用？加在哪里的呢？ 3.細胞裂解液自己配的，丁香園查的配方有幾種版本，有的加SDS,有的加吐溫，有的只是Tris-hcl，nacl,這些，要怎么選擇呢？ 做了這么久western blot一直沒搞懂這些問題！ 希望高手指點！ |
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2樓2013-02-28 20:53:46
cicelyzh
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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如果你要看IPTG是否能誘導(dǎo)出目的蛋白，可以直接收集菌體后加SDS上樣buffer后跑膠。因為SDS上樣buffer本身能裂解細菌，不用超聲，得到的樣品是細菌總蛋白。 超聲是為了得到可溶的活性蛋白。確定IPTG誘導(dǎo)成功后要確定目的蛋白是以可溶形式存在的還是在包涵體里面。是用不含SDS的裂解液，超聲后離心取上清得到可溶蛋白，然后取總蛋白、可溶蛋白、沉淀三個樣品跑SDS-PAGE。 尿素是為了把包涵體中的變性蛋白復(fù)性時用的。 細胞裂解液的成分要根據(jù)不同的目的配制。 |
3樓2013-03-01 00:58:01
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