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[求助] WB沒(méi)有條帶啊

今天做了一次WB。用的蛋白和抗體在此之前試著做過(guò)一次DOT BLOT，把抗體的使用條件都摸索了一遍，且取得了較好的結(jié)果。但是相同的抗體和蛋白一起來(lái)做WB，顯影時(shí)一條條帶也看不到。蛋白上樣量比以前還增加了。我在想是轉(zhuǎn)膜的問(wèn)題嗎？我的目的條帶最大100kD，最小17kD,0.45的膜濕轉(zhuǎn)，100mA,2小時(shí)。求助經(jīng)驗(yàn)人士給予指導(dǎo)，謝謝

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1樓 2013-03-05 21:09:55

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cicelyzh

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如果懷疑是轉(zhuǎn)膜的問(wèn)題，可以跑預(yù)染的marker，看看marker轉(zhuǎn)的情況。或者轉(zhuǎn)完膜后用麗春紅染一下膜看看。

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2樓2013-03-06 07:33:04

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liusiapril

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2樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-06 07:33:04
如果懷疑是轉(zhuǎn)膜的問(wèn)題，可以跑預(yù)染的marker，看看marker轉(zhuǎn)的情況�；蛘咿D(zhuǎn)完膜后用麗春紅染一下膜看看。

膜上有72和95兩條帶，小帶有部分在濾紙上有印記。但是大的那個(gè)條帶在膜上也沒(méi)有出現(xiàn)，今天試著用麗春紅染色看看。

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3樓2013-03-06 08:38:29

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zx1984

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liusiapril: 金幣+1 2013-03-06 10:45:32

確定用的膜對(duì)了，然后轉(zhuǎn)膜時(shí)不要有氣泡，抗體孵育的時(shí)候不要錯(cuò)了

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4樓2013-03-06 09:36:16

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4樓: Originally posted by zx1984 at 2013-03-06 09:36:16
確定用的膜對(duì)了，然后轉(zhuǎn)膜時(shí)不要有氣泡，抗體孵育的時(shí)候不要錯(cuò)了

膜對(duì)，轉(zhuǎn)膜時(shí)也保證沒(méi)有氣泡，抗體孵育是一抗4℃過(guò)夜二抗室溫40分鐘，都是以前摸索好的條件啊。。。

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5樓2013-03-06 10:45:16

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還想再請(qǐng)教一下，麗春紅是不是只能用于轉(zhuǎn)膜后未封閉前的膜染色，我一套流程走下來(lái)曝光后發(fā)現(xiàn)沒(méi)有條帶再染，似乎沒(méi)有效果啊，染不上的感覺(jué)。。。

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6樓2013-03-06 10:48:32

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2樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-06 07:33:04
如果懷疑是轉(zhuǎn)膜的問(wèn)題，可以跑預(yù)染的marker，看看marker轉(zhuǎn)的情況。或者轉(zhuǎn)完膜后用麗春紅染一下膜看看。

還想請(qǐng)教一下，麗春紅染色是不是只針對(duì)于轉(zhuǎn)膜后封閉前的膜，我這一張曝光后未見(jiàn)條帶的膜用麗春紅染色后沒(méi)有效果，什么也沒(méi)有染上。配方是0.1g麗春紅，5ml乙酸，定容至100ml。謝謝

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7樓2013-03-06 10:53:52

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你這個(gè)顯然是轉(zhuǎn)膜不好, PVDF膜需要用甲醇先活化的,看看'分子克隆指南'上的介紹

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8樓2013-03-06 11:07:05

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轉(zhuǎn)膜時(shí)也有注意避免有氣泡的，膜的活化和平衡也處理了，還有什么原因可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜出問(wèn)題嗎？

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9樓: Originally posted by liusiapril at 2013-03-06 12:15:22
轉(zhuǎn)膜時(shí)也有注意避免有氣泡的，膜的活化和平衡也處理了，還有什么原因可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜出問(wèn)題嗎？

如果你再想不到有問(wèn)題,就再作一次,good luck,其實(shí)有時(shí)候, 一些小問(wèn)題,根本就注意不到,比方電極反了, 或者膜和膠哪個(gè)先放,哪個(gè)后放,這你可能都知道,但做的時(shí)候,一不小心錯(cuò)了,,再認(rèn)真做一次

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10樓2013-03-06 12:49:33

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