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追尋風(fēng)輕揚(yáng)金蟲 (小有名氣)
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[求助]
重新合成的內(nèi)參引物有引物二聚體該咋辦？ 已有1人參與
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最近在做熒光定量PCR，我之前合成的內(nèi)參引物擴(kuò)增樣品效果還行，引物二聚體很少。后來內(nèi)參引物用完了，重新合成了兩管，結(jié)果再擴(kuò)增，引物二聚體就很多了。做了溫度梯度PCR，從57度到64度，各個(gè)溫度都有引物二聚體。請(qǐng)問這是怎么回事呢？我的反應(yīng)體系是10ul，引物加了0.5ul，模板1ul，引物濃度時(shí)10umol/L的。今天把引物稀釋了4倍、16倍、32倍、64倍，結(jié)果只有稀釋四倍的擴(kuò)增出條帶，但是還有引物二聚體。請(qǐng)問在不重新合成引物的情況下，還可以怎么調(diào)整條件？ PS:熒光定量的產(chǎn)物都是挺小的，最大也就200bp左右，我用的反應(yīng)程序里面72度延伸時(shí)間是45秒，請(qǐng)問這會(huì)不會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)引物二聚體增加？減少延伸時(shí)間可行嗎？減少退火時(shí)間呢？ |
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