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whmxiaoyumi

新蟲 (初入文壇)

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專業(yè): 基因表達(dá)調(diào)控與表觀遺傳學(xué)

[求助] 關(guān)于定量PCR擴(kuò)增效率的若干問題

我做定量PCR（qRT-PCR）一段時(shí)間了，由于模板少的情況基因表達(dá)量低，很多樣本會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增不出來的情況。每當(dāng)CT值到32以上，得到的結(jié)果就各種不穩(wěn)定，為此很是糾結(jié)。看了一下各路帖子，我大概總結(jié)了一下可能的辦法如下：
1.引物特異性反轉(zhuǎn)錄。在反轉(zhuǎn)錄時(shí)加入目標(biāo)基因上游3’ 引物。對(duì)目的片段進(jìn)行特異性的反轉(zhuǎn)錄。
2.加入Mg2+。對(duì)于普通PCR中加入Mg2+，確實(shí)可以提高擴(kuò)增效率。但是對(duì)于定量PCR，是否有同樣的效果我不太清楚。另外，我用的是SYBR GREEN MASTER MIX，說明書指出buffer已經(jīng)是優(yōu)化好的，不建議再添加 Mg2+，說這樣會(huì)降低擴(kuò)增的特異性。
3.QPCR三步擴(kuò)增程序，以前一直是用的二步擴(kuò)增即 95C 15S 60C 45S 。后來有建議用三步擴(kuò)增 95C 15S 60C 20S 72C 30S，這個(gè)擴(kuò)增程序我用過對(duì)于二聚體有比較明顯的效果，對(duì)于特異性的效果似乎不明顯。有同學(xué)說三步的擴(kuò)增會(huì)提高擴(kuò)增效率，不知道這一點(diǎn)有沒有大神指點(diǎn)一下。
4.最近聽說Eva-green。有些人說Eva-green要比SYBR Green I要好，對(duì)PCR反應(yīng)抑制小。不知道有沒有用過的同學(xué)分享一下經(jīng)驗(yàn)。在定量PCR時(shí)，是否能夠明顯降低結(jié)果CT值呢？
5.takara cellamp 試劑盒，號(hào)稱單細(xì)胞可以做PCR。我打電話去問了一下代理商，他們表示用的人不多。
對(duì)于這些辦法，我都不能百分百確定是否有效果，本應(yīng)該自己去試的，不過還是想問問大家的意見。不知道各位大神對(duì)于上面的各項(xiàng)策略有沒有具體的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，或者有更好的解決辦法。
非常感謝！

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1樓 2013-03-15 16:42:05

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hy_sandra

銅蟲 (初入文壇)

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回復(fù)此樓

科研是無止盡的

2樓2013-03-15 21:50:15