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Cheryl1117新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助各位大神--關(guān)于PCR的問題
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最近設(shè)計了一對引物擴(kuò)增一段序列，用質(zhì)粒做的模板，目的條帶3000bp左右，擴(kuò)增條件：95 5min;35循環(huán)（95 30s--60 30s---72 1min）; 72 7min . 第一次擴(kuò)增用“r Taq酶”，結(jié)果是圖1，稀釋100倍的擴(kuò)增成功，稀釋1000倍的只有一個擴(kuò)出來，但都含有其他的雜帶。第二次擴(kuò)增用“r Taq酶和exTaq酶”同時擴(kuò)增，模板添加量分別是1微升（圖2）和2微升（圖3），結(jié)果1微升的擴(kuò)增條帶比2微升的要亮，另外，exTaq酶不但沒有擴(kuò)增出來目的條帶（僅僅在稀釋1000倍的1微升中有一個）反而雜條帶擴(kuò)增比較亮，這是什么原因呢？ 求各位大神指導(dǎo)~~~~ 1.jpg 2.jpg 3.jpg |
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Cheryl1117
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| PCR做35循環(huán)的情況下PCR檢測產(chǎn)物時已經(jīng)達(dá)到飽和，終產(chǎn)物的濃度不能完全反映模板濃度。此外，你說的1微升模板比2微升的亮，需要在一塊膠上比較。有雜帶說明是引物特異性不高或者PCR條件未達(dá)到最優(yōu)。你可以試試優(yōu)化退火溫度。此外，擴(kuò)增3kb片段，對taq酶來說，每個循環(huán)的延伸時間應(yīng)該為3分鐘。不同的聚合酶的最適條件可能會有一定差別，需要分別做優(yōu)化。 |
3樓2013-04-01 23:49:36
lidonghong
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4樓2013-04-02 08:36:50
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