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Cheryl1117新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助各位大神--關(guān)于PCR的問題
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最近設(shè)計(jì)了一對(duì)引物擴(kuò)增一段序列，用質(zhì)粒做的模板，目的條帶3000bp左右，擴(kuò)增條件：95 5min;35循環(huán)（95 30s--60 30s---72 1min）; 72 7min . 第一次擴(kuò)增用“r Taq酶”，結(jié)果是圖1，稀釋100倍的擴(kuò)增成功，稀釋1000倍的只有一個(gè)擴(kuò)出來，但都含有其他的雜帶。第二次擴(kuò)增用“r Taq酶和exTaq酶”同時(shí)擴(kuò)增，模板添加量分別是1微升（圖2）和2微升（圖3），結(jié)果1微升的擴(kuò)增條帶比2微升的要亮，另外，exTaq酶不但沒有擴(kuò)增出來目的條帶（僅僅在稀釋1000倍的1微升中有一個(gè)）反而雜條帶擴(kuò)增比較亮，這是什么原因呢？ 求各位大神指導(dǎo)~~~~ 1.jpg 2.jpg 3.jpg |
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eiieen
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我們做過以質(zhì)粒為模板，目的片段長(zhǎng)度5000bp。 所以按你的3000bp目的條帶來建議： 1, 95度2:30分鐘預(yù)變性，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)增加雜帶 2, 72度延伸時(shí)間3:10分鐘 3，質(zhì)粒測(cè)測(cè)濃度，稀釋至20ng~100ng即可，這樣的PCR產(chǎn)物跑出來的電泳沒有原模板的雜帶。 4，跑電泳的時(shí)候加一個(gè)對(duì)照：作為模板的質(zhì)粒500納克-1微克 |
9樓2013-04-03 09:10:32
alice
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2樓2013-04-01 21:23:22
cicelyzh
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Cheryl1117: 金幣+1, ★有幫助 2013-04-02 19:40:08
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Cheryl1117: 金幣+1, ★有幫助 2013-04-02 19:40:08
| PCR做35循環(huán)的情況下PCR檢測(cè)產(chǎn)物時(shí)已經(jīng)達(dá)到飽和，終產(chǎn)物的濃度不能完全反映模板濃度。此外，你說的1微升模板比2微升的亮，需要在一塊膠上比較。有雜帶說明是引物特異性不高或者PCR條件未達(dá)到最優(yōu)。你可以試試優(yōu)化退火溫度。此外，擴(kuò)增3kb片段，對(duì)taq酶來說，每個(gè)循環(huán)的延伸時(shí)間應(yīng)該為3分鐘。不同的聚合酶的最適條件可能會(huì)有一定差別，需要分別做優(yōu)化。 |
3樓2013-04-01 23:49:36
lidonghong
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1，又雜帶說明引物的特異性不是很好，可提高退火溫度 2，不同的擴(kuò)增酶效率不一樣，有些保真性好的酶擴(kuò)增效率往往會(huì)低一點(diǎn) 3，你的目的條帶是3kbp，三步循環(huán)中72度延伸3min，1000bp/min 4，模板濃度太高是會(huì)抑制PCR的擴(kuò)增效率的，所以不是模板量越多越好，反之太低也是會(huì)降低擴(kuò)增效率的 |
4樓2013-04-02 08:36:50
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