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mahoumeimei金蟲 (小有名氣)
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[求助]
定量PCR-引物二聚體問題
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前段時(shí)間做了絕對(duì)定量，融解曲線顯示有雜峰，懷疑是引物二聚體。但是產(chǎn)物電泳圖上卻沒有看到明顯的引物二聚體。樣品平行性還不錯(cuò)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率是0.9947。我實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊膊恍枰獪?zhǔn)確地知道每個(gè)樣品目標(biāo)基因的copy值，只需要看到目標(biāo)基因的變化趨勢(shì)就好了。請(qǐng)問這樣的話，這些結(jié)果能用嗎？因?yàn)閷?shí)驗(yàn)已經(jīng)基本結(jié)束了，不想再重新設(shè)計(jì)引物折騰了。 希望大家給點(diǎn)建議，非常感謝！ 5B-9C 2.jpg 圖片1.jpg |
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cicelyzh
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可能是引物有二級(jí)結(jié)構(gòu)吧，重新設(shè)計(jì)引物看看吧。引物很便宜的，多設(shè)計(jì)幾對(duì)。還有一個(gè)辦法，雖然對(duì)做定量很不好，但是你只是想要看關(guān)系，你可以設(shè)計(jì)PCR程序時(shí)，在每個(gè)循環(huán)中加入82°C 10S （熔接引物二聚體），再時(shí)時(shí)讀取熒光。 |
5樓2013-04-09 00:54:49
mahoumeimei
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cicelyzh
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| 你的熔解曲線不是一般的有問題，從膠上看不到明顯的引物二聚體不能說明其不存在。如果只是看趨勢(shì)，可以直接做半定量PCR跑膠看結(jié)果。如果一定要做熒光定量，我認(rèn)為你需要對(duì)體系進(jìn)行優(yōu)化。標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2不錯(cuò)，只能說明標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性還可以，擴(kuò)增效率才是關(guān)鍵。你是否對(duì)PCR體系進(jìn)行了優(yōu)化？我覺得你可以做一下退火溫度梯度，降低引物濃度。實(shí)在不行只能重新設(shè)計(jì)引物。 |
3樓2013-04-08 00:44:41
mahoumeimei
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4樓2013-04-08 09:38:05
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