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zhlsmile鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
雙質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入酵母細胞
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求助 請問要將兩個質(zhì)粒一次同時轉(zhuǎn)入釀酒酵母細胞 需要注意哪些問題呢？ 我的轉(zhuǎn)不出來 具體情況是這樣的： 質(zhì)粒大小分別是10KB和8000bp左右，有各自的選擇標記，用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，質(zhì)粒濃度一般用100ng 轉(zhuǎn)入酵母細胞 請問這個轉(zhuǎn)入的情況還需要注意哪些 或者有更好的辦法？ 謝謝啦 |
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gyesang: 回帖置頂 2013-05-03 18:13:00
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酵母轉(zhuǎn)化效率受到很多因素的影響，我3個載體共轉(zhuǎn)基本上效率都非常高 AH109單克隆接種于3ml YPDA中30°250r/min過夜搖菌 1:50接種，同樣條件搖菌至OD=0.5（約5h）左右 準備質(zhì)�；旌弦后w，總質(zhì)量約8ug,三個質(zhì)粒的摩爾數(shù)比約為1:1:1,總體積50ul,不足的用水補齊（見附件） 準備ssDNA, 6*25=55*3, PCR儀中94°10min,放冰上備用 30°預熱液體YPDA培養(yǎng)基 2ml tube收集菌體 3000r/min離心，滅菌水洗兩次 900ul水重懸菌體，加100ul 1M LiAc, 顛倒混勻，30°溫浴5min，12000r/min 5s,收集菌體，棄除干凈上清 用50ul的質(zhì)�；旌弦狠p輕重懸菌體，加入36ul 1M LiAc 和25ul 變性處理后冰上保存的ssDNA,輕輕混勻后加入240ul 50%PEG6000，適當vortex混勻 42°水浴熱擊45min，30°培養(yǎng)箱預熱SD平板 12000r/min 2min, 盡量棄除干凈上清，加1ml YPDA(30°預熱)/2ml tube, 手搖混勻 30°，200r/min 復蘇1-2h 5000r/min 離心4min, 盡量棄除干凈上清，加100ul滅菌水，重懸，吹吸混勻 涂板，30°培養(yǎng)3-4d，觀察，照相 |
2樓2013-05-03 16:35:07
咭呀嘎
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| 我有做過雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)酵母的實驗，用的也是LiAc和PEG的方法，最后是用兩種抗性篩選的。但是涂板之后，板上基本不長。猜想是因為共轉(zhuǎn)效率比較低，而且是兩種抗性篩選。所以我在涂板的同時還會同時取轉(zhuǎn)化后的菌液進行搖菌，在含有兩種抗生素的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再平板劃線就可以得到單菌落，最后進行鑒定。希望能幫到你。 |
3樓2013-05-03 19:10:06
zhlsmile
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