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瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)嚴重的拖帶
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最近跑的電泳，膠上會有拖帶，空白對照也會有拖帶（樣品為PCR產物），不知道是哪里出了問題，請教一下高手��！ 2013.05.04.jpg |
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【答案】應助回帖
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liuxiuaza(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖應助！ 2013-05-07 00:52:28
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下面的內容本來是我回答另一貼的，但是回答的文不對題，對你的帖子到可能是切題的，請參考。 你的PCR結果電泳彌散，可能是非特異性擴增多，即出現(xiàn)非特異性擴增帶。也就是：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。 非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過低、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關（過多一般是超過25次循環(huán)，你只循環(huán)5次應該沒有問題）。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。 其對策有：首先可以提高鎂離子的濃度， 由1.0mmol/L起以0.05mmol/L為單位逐漸上升，最高不超過10.0mmol/L。提高鎂離子的濃度無效的話，調整引物濃度（你的PCR結果電泳拖尾，可能是非特異性擴增多，因此應適當降低引物濃度），適當增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。減低酶量或調換另一來源的酶。適當提高退火溫度。以上都不行則要重新設計引物。每種調整均可以分梯度進行。 切膠回收一般如果剪切力不大的話，一般不會引起DNA斷裂。 另外可能是PCR實驗時發(fā)生了污染。污染原因： (一)標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。 (二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染. (三)PCR擴增產物污染:這是PCR反應中最主要最常見的污染問題，因為PCR產物拷貝量 大，遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。 |
2樓2013-05-06 16:42:13
凌波麗
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【答案】應助回帖
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下面的內容本來是我回答另一貼的，但是回答的文不對題，對你的帖子到可能是切題的，請參考。把錯的地方改過來了（與你的問題不對應的半句話去掉了），另外，少做了一些補充。 你的PCR結果電泳彌散，可能是非特異性擴增多，即出現(xiàn)非特異性擴增帶。也就是：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。 非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度不合適（有些帖子一味的說Mg2+離子濃度過高會引起非特異性擴增，這是問題的一個方面，Mg2+離子濃度過低也同樣會引起非特異性擴增）、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關（過多循環(huán)一般是超過25次循環(huán)）。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。 其對策有：首先可以提高鎂離子的濃度， 由1.0mmol/L起以0.05mmol/L為單位逐漸上升，最高不超過10.0mmol/L。提高鎂離子的濃度無效的話，調整引物濃度（你的PCR結果電泳拖尾，可能是非特異性擴增多，因此應適當降低引物濃度），適當增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。減低酶量或調換另一來源的酶。適當提高退火溫度。以上都不行則要重新設計引物。每種調整均可以分梯度進行。 切膠回收一般如果剪切力不大的話，一般不會引起DNA斷裂。 另外可能是PCR實驗時發(fā)生了污染。污染原因： (一)標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。 (二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染. (三)PCR擴增產物污染:這是PCR反應中最主要最常見的污染問題，因為PCR產物拷貝量 大，遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。 |
3樓2013-05-06 16:45:53
stevenshi021
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這個笑臉哭臉帶我感覺不是PCR的問題而是電泳本身的問題。解決方法：1膠凝結的時間稍微長一點，或者在跑得時候放入冰箱1min(-20)使得膠徹底的凝結；2電泳過程中使用新的緩沖液且電壓低一點一般TBE不要超過120V，TAE不要超過100V，避免電腦過程中產生大量的熱，如果電泳時間過長建議冰上進行。因為我們實驗室常用的都是低熔點瓊脂糖，在溫度高于40°的情況下其內部結構就會不穩(wěn)地。最后的那種彌散帶我感覺可能是你的dNTP多了！ 希望對你有用。 |
4樓2013-05-06 23:58:40
5樓2013-05-07 11:32:33
6樓2013-05-07 11:33:31
7樓2013-05-07 11:41:37
8樓2013-05-07 16:30:51
9樓2013-05-10 10:28:08
10樓2013-07-30 11:41:18
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