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374695805新蟲 (初入文壇)
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[求助]
DNA洗滌沉淀
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（一）DNA和載體經(jīng)T4 Ligase連接以后要進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，所以連接體系要純化，步驟如下： (1)加入2.5 μl（1/10量）的3 M CH3COONa（pH5.2）。 (2)加入62.5 μl（2.5倍量）的冷無(wú)水乙醇，-20℃放置30～60分鐘。 (3)離心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。 (4)25～50 μl TE溶解，10～20 μl轉(zhuǎn)化至100 μl的感受態(tài)細(xì)胞中。 之前做了幾次連接和電轉(zhuǎn)化，都沒(méi)有成功，陽(yáng)性對(duì)照轉(zhuǎn)化了，陰性對(duì)照沒(méi)轉(zhuǎn)化，連接產(chǎn)物也沒(méi)轉(zhuǎn)化，估計(jì)洗滌沉淀過(guò)程中把連接產(chǎn)物連同上層溶液一起倒掉去除。（電轉(zhuǎn)化過(guò)程中的放電時(shí)間一般介于4~5ms左右，但是連接產(chǎn)物的放電時(shí)間跟上述時(shí)間有較大差異，相差2個(gè)數(shù)量級(jí)）。 請(qǐng)問(wèn)，第(3)步中，離心回收沉淀，由于DNA用肉眼根本看不到，怎樣保證棄去上層溶液的時(shí)候不會(huì)把管底的DNA沉淀一起倒掉�。壳缶唧w的操作要點(diǎn)！ （二）分布雙酶切的具體步驟是什么？切完一個(gè)之后用什么方法純化？純化試劑盒還是和上述（一）所提到的洗滌沉淀？ |
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cicelyzh
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
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2樓2013-05-09 02:22:33
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