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sunzhengwang鐵蟲 (小有名氣)
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RNA A260/280>2 是神馬情況？ 已有1人參與
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好質(zhì)量的RNA 260/280值應(yīng)該在1.9-2.0， 但是最近提取的RNA A260/280>2，A260/230>2， 請問各位蟲友，這是個神馬情況？ |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 | 專業(yè)電子書 | 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 【分子生物】EPI帖 |
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如果在2.1之上，說明可能存在DNA污染。此外，單純看比值意義不大，下列文字僅供參考： 1. A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波長，最佳測量值的范圍為 0.1 至 1.0。如果不在此范圍，稀釋或濃縮樣品，使 之在此范圍內(nèi)；如果吸光度小于 0.05，檢查是否存在操作因素（如移液不準(zhǔn)確，樣品內(nèi)有懸浮物等）影響。 DNA 樣品的 A260 吸光度值是否>0.1。（請注意，這個值跟儀器無關(guān)，核酸的吸光度必需大于 0.1，其值才 有效和可靠，因?yàn)闃悠分械碾s質(zhì)和顆粒這些不純物的干擾通常會對光有一定吸收，其值<0.1）； 2. A280nm, A270nm 是蛋白最高吸收峰的吸收波長，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評估：純 DNA 的 A260/A280 比值為 1.8，純 RNA 為 2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質(zhì)的污染，需要純化樣品。比值=1.5 相當(dāng)于 50％ 蛋白質(zhì)/DNA 溶液.酚的最大吸收峰在 270nm。 3. A230nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評估：純 DNA 和 RNA 的 A260/A230 比值為 2.5。若比值小于 2.0 標(biāo)明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機(jī)溶劑污染，需要純化樣品。A230 產(chǎn)生 負(fù)值主要是由于在很低 DNA 濃度的溶液中的一些其他成分的干擾所導(dǎo)致的。在下一個測定中，需要降低樣 品的稀釋度，A230 的負(fù)值會被校正。 4. A320nm 或 A340nm 為檢測溶液樣品的濁度和其他干擾因子。該值應(yīng)該接近0.0。如果不是，標(biāo)明溶液中有懸浮物，需要純化樣品。純樣品的A320一般是 0。 5. A260/A280和A260/A230 是核酸純度的指示值。純度好的DNA或RNA，在pH7-8.5 下A260 / A280的比值應(yīng)該在2.0 或2.5。純凈的樣品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物、鹽（胍鹽）等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0 。 當(dāng) 0.5％BSA蛋白質(zhì)污染時，蛋白污染會導(dǎo)致260和280的數(shù)值都下降，其凈結(jié)果是260/280比值下降，但260/280的比值變化并不顯著，正如分子克隆3所說。但蛋白殘留會導(dǎo)致230的數(shù)值顯著上升，顯著影響260/230的比值。也就是說，如果RNA樣品的260/280＝1.7，260 /230＝0.5，那么就應(yīng)該考慮污染原因不是胍鹽殘留，而是蛋白殘留. 其他： 用分光光度計(jì)測量RNA時，用水而不是用TE 緩沖液稀釋RNA樣品會造成A260/A280比值下降。原因是低離子強(qiáng)度和低pH溶液會增加280 nm處的光吸收值。 加氯仿離心后取上清的時候千萬不要貪多 ，那樣就很容易被蛋白污染，所以現(xiàn)在一般取400ul左右。 當(dāng)260/230<1時，只有兩種情況。一是胍鹽污染，二是蛋白污染。 |
15樓2013-05-10 11:39:21
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2樓2013-05-09 09:31:26
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