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小孩5406新蟲 (小有名氣)
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[求助]
同一個(gè)蛋白誘導(dǎo)之后大小變小了，而且超聲過后就沒有了，這是什么情況？求指導(dǎo)！
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我最近在做蛋白誘導(dǎo)，可是同樣一個(gè)蛋白，之前師姐做的時(shí)候很順利，都能純化出來，可是現(xiàn)在我發(fā)現(xiàn)我誘導(dǎo)之后蛋白比之前師姐誘導(dǎo)的變小了，不知道是什么情況？質(zhì)粒做過酶切也測過序，都是正確的，有沒有人知道這是什么情況，我該怎么辦？快糾結(jié)死了~做了快兩個(gè)月了，一直沒進(jìn)展。 我誘導(dǎo)之后（用箭頭指示的）.png 師姐誘導(dǎo)之后（用箭頭指示）.png 超聲過后我誘導(dǎo)的蛋白就沒有了.png |
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【答案】應(yīng)助回帖
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wizardfan: 金幣+1, thanks for posting 2013-05-10 23:56:03
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看膠你們誘導(dǎo)的蛋白大小不是一樣嗎（～５５ｋＤ），超生后不見了那是因?yàn)榈鞍卓扇苄圆�，你在誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)候可以減低溫度，減低IPTG濃度使得細(xì)胞有足夠時(shí)間去折疊，此外對含有什么disulfides bonds的蛋白可以使用那些稀奇古怪的宿主試試。問題闡述的稍微明朗一點(diǎn)我愿意更貼，因?yàn)榈浆F(xiàn)在我沒有完全理解你的問題。 祝好 |
2樓2013-05-10 11:14:18
小孩5406
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按道理的話蛋白大小應(yīng)該是56kd，應(yīng)該是在55條帶上面一點(diǎn)，現(xiàn)在明顯可以看到我誘導(dǎo)之后蛋白位置低于55的條帶。 那么我可以認(rèn)為我誘導(dǎo)的蛋白跟師姐誘導(dǎo)的那個(gè)是一樣的嗎？因?yàn)槲覔?dān)心我現(xiàn)在誘導(dǎo)出來的不是想要的蛋白，所以后續(xù)的純化才不順利。 我現(xiàn)在的誘導(dǎo)條件是37℃，5h。IPTG濃度是0.5mM。載體是pGEX-5X-1,宿主是Escherichia coli BL21 cells。 超聲的時(shí)候應(yīng)該注意什么？ |
3樓2013-05-10 13:23:13
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樓主！我來說幾點(diǎn)，希望能給你點(diǎn)建議： 1.同樣的蛋白在不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠上，呈現(xiàn)的電泳圖是不一樣的；即使是同濃度的凝膠，不同的電泳條件，如有人喜歡恒壓，而有人選擇恒流，導(dǎo)致結(jié)果可能出現(xiàn)細(xì)微的差別。只要在準(zhǔn)確分子量上下浮動(dòng)不大，一般問題是不大的，那可能就是你的蛋白。 2.你的蛋白是有GST標(biāo)簽的吧？你可以利用GE的GST柱純化，得到蛋白的純度應(yīng)該是挺高的，將得到的蛋白再做個(gè)western blotting。如果你還有HIS標(biāo)簽，可以建議你做HIS的western blotting，his的特異性可能GST的好些！而且GST的標(biāo)簽容易斷裂，導(dǎo)致蛋白降解！ 3.如果你還不敢確定，你可以先跑個(gè)SDS-PAGE，染色后，切膠送Modi-tof，根據(jù)多肽質(zhì)譜圖來確定了！ 4.破碎，本人還是有點(diǎn)小經(jīng)驗(yàn)的，與你分享下吧！ a.超聲破碎整個(gè)過程需要在冰水混合物的冰浴上進(jìn)行！水不要多也不要太少！ b.破碎前，加少量溶菌酶和核酸酶。溶菌酶可以減少破菌時(shí)間，核酸酶可以水解核酸。還可以加點(diǎn)還原劑，如果你的半胱氨酸較多的話；也可以加點(diǎn)蛋白酶抑制劑！ c.超生破碎參數(shù)要設(shè)置恰當(dāng)，一般間隙需要是超聲的2倍，建議選擇6s間隙，和3s破碎！如果樣品量少于100ml， 建議500W超聲20min，大概就行了！溶液就澄清了，不會(huì)那么粘�。�！如果渾濁，但不粘，可能是包涵體！ d.破碎時(shí)，溫度要控制好！過10min，攪拌一下樣品，不要使樣液溫度很高，碰一下燒杯壁就能感覺到！如果溫度高，那就先暫停一下，等溫度降低，并且確保在冰浴中！或者改變超聲參數(shù)，改為10s間隙，5s破碎，全程20~25min！ f.破碎完的蛋白離心之后要立即純化，因?yàn)槠扑楹�，樣液中可能有許多蛋白酶，長時(shí)間放置會(huì)降解蛋白！ 建議你一下：你破碎完之后的上清上樣量上少點(diǎn)！太模糊了，不利于你觀察！我看了一下，你那還是有點(diǎn)蛋白的！只是太模糊了，而且你也沒過柱純化！沒起到富集的作用！ |
4樓2013-05-10 22:46:17
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9樓2013-05-13 14:53:10
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10樓2013-05-13 15:10:06
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