 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2301 | 回復(fù): 9 | |||
| 本帖產(chǎn)生 1 個 BioEPI ，點(diǎn)擊這里進(jìn)行查看 | |||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
小孩5406新蟲 (小有名氣)
|
[求助]
同一個蛋白誘導(dǎo)之后大小變小了，而且超聲過后就沒有了，這是什么情況？求指導(dǎo)！
|
||
|
我最近在做蛋白誘導(dǎo)，可是同樣一個蛋白，之前師姐做的時候很順利，都能純化出來，可是現(xiàn)在我發(fā)現(xiàn)我誘導(dǎo)之后蛋白比之前師姐誘導(dǎo)的變小了，不知道是什么情況？質(zhì)粒做過酶切也測過序，都是正確的，有沒有人知道這是什么情況，我該怎么辦？快糾結(jié)死了~做了快兩個月了，一直沒進(jìn)展。 我誘導(dǎo)之后（用箭頭指示的）.png 師姐誘導(dǎo)之后（用箭頭指示）.png 超聲過后我誘導(dǎo)的蛋白就沒有了.png |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
環(huán)境285分，過六級，求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
學(xué)碩化學(xué)工程與技術(shù)，一志愿中國海洋大學(xué)320+求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
能源動力 調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
348求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
材料化工340求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
08工科求調(diào)劑290分
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
材料調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
372分材料與化工（085600）一志愿湖南大學(xué)求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
283分材料與化工求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
一志愿華東理工大學(xué)，080500學(xué)碩，317分，求調(diào)劑
已經(jīng)有12人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 原核表達(dá)蛋白變小
已經(jīng)有4人回復(fù)
小孩5406
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 0.5
- 帖子: 82
- 在線: 23.4小時
- 蟲號: 1986045
- 注冊: 2012-09-08
- 專業(yè): 免疫生物學(xué)
|
按道理的話蛋白大小應(yīng)該是56kd，應(yīng)該是在55條帶上面一點(diǎn)，現(xiàn)在明顯可以看到我誘導(dǎo)之后蛋白位置低于55的條帶。 那么我可以認(rèn)為我誘導(dǎo)的蛋白跟師姐誘導(dǎo)的那個是一樣的嗎？因?yàn)槲覔?dān)心我現(xiàn)在誘導(dǎo)出來的不是想要的蛋白，所以后續(xù)的純化才不順利。 我現(xiàn)在的誘導(dǎo)條件是37℃，5h。IPTG濃度是0.5mM。載體是pGEX-5X-1,宿主是Escherichia coli BL21 cells。 超聲的時候應(yīng)該注意什么？ |
3樓2013-05-10 13:23:13
stevenshi021
新蟲 (小有名氣)
- BioEPI: 1
- 應(yīng)助: 61 (初中生)
- 金幣: 545.3
- 紅花: 5
- 帖子: 276
- 在線: 35.1小時
- 蟲號: 2272292
- 注冊: 2013-02-03
- 專業(yè): 生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wizardfan: 金幣+1, thanks for posting 2013-05-10 23:56:03
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wizardfan: 金幣+1, thanks for posting 2013-05-10 23:56:03
|
看膠你們誘導(dǎo)的蛋白大小不是一樣嗎（～５５ｋＤ），超生后不見了那是因?yàn)榈鞍卓扇苄圆�，你在誘導(dǎo)表達(dá)時候可以減低溫度，減低IPTG濃度使得細(xì)胞有足夠時間去折疊，此外對含有什么disulfides bonds的蛋白可以使用那些稀奇古怪的宿主試試。問題闡述的稍微明朗一點(diǎn)我愿意更貼，因?yàn)榈浆F(xiàn)在我沒有完全理解你的問題。 祝好 |
2樓2013-05-10 11:14:18
不轉(zhuǎn)錄的DNA
金蟲 (小有名氣)
- BioEPI: 3
- 應(yīng)助: 47 (小學(xué)生)
- 金幣: 573.5
- 散金: 4
- 紅花: 2
- 帖子: 157
- 在線: 85.2小時
- 蟲號: 2454044
- 注冊: 2013-05-08
- 性別: GG
- 專業(yè): 蛋白質(zhì)組學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wizardfan: 金幣+5, thanks for the detailed analysis 2013-05-11 00:05:59
wizardfan: 金幣+2, BioEPI+1, 謝謝詳細(xì)的分析，繼續(xù)保持 2013-05-12 09:39:26
小孩5406: 金幣+5, ★★★很有幫助, 很詳細(xì) 2013-05-12 12:52:23
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wizardfan: 金幣+5, thanks for the detailed analysis 2013-05-11 00:05:59
wizardfan: 金幣+2, BioEPI+1, 謝謝詳細(xì)的分析，繼續(xù)保持 2013-05-12 09:39:26
小孩5406: 金幣+5, ★★★很有幫助, 很詳細(xì) 2013-05-12 12:52:23
|
樓主！我來說幾點(diǎn)，希望能給你點(diǎn)建議： 1.同樣的蛋白在不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠上，呈現(xiàn)的電泳圖是不一樣的；即使是同濃度的凝膠，不同的電泳條件，如有人喜歡恒壓，而有人選擇恒流，導(dǎo)致結(jié)果可能出現(xiàn)細(xì)微的差別。只要在準(zhǔn)確分子量上下浮動不大，一般問題是不大的，那可能就是你的蛋白。 2.你的蛋白是有GST標(biāo)簽的吧？你可以利用GE的GST柱純化，得到蛋白的純度應(yīng)該是挺高的，將得到的蛋白再做個western blotting。如果你還有HIS標(biāo)簽，可以建議你做HIS的western blotting，his的特異性可能GST的好些！而且GST的標(biāo)簽容易斷裂，導(dǎo)致蛋白降解！ 3.如果你還不敢確定，你可以先跑個SDS-PAGE，染色后，切膠送Modi-tof，根據(jù)多肽質(zhì)譜圖來確定了！ 4.破碎，本人還是有點(diǎn)小經(jīng)驗(yàn)的，與你分享下吧！ a.超聲破碎整個過程需要在冰水混合物的冰浴上進(jìn)行！水不要多也不要太少！ b.破碎前，加少量溶菌酶和核酸酶。溶菌酶可以減少破菌時間，核酸酶可以水解核酸。還可以加點(diǎn)還原劑，如果你的半胱氨酸較多的話；也可以加點(diǎn)蛋白酶抑制劑！ c.超生破碎參數(shù)要設(shè)置恰當(dāng)，一般間隙需要是超聲的2倍，建議選擇6s間隙，和3s破碎！如果樣品量少于100ml， 建議500W超聲20min，大概就行了！溶液就澄清了，不會那么粘�。�！如果渾濁，但不粘，可能是包涵體！ d.破碎時，溫度要控制好！過10min，攪拌一下樣品，不要使樣液溫度很高，碰一下燒杯壁就能感覺到！如果溫度高，那就先暫停一下，等溫度降低，并且確保在冰浴中！或者改變超聲參數(shù)，改為10s間隙，5s破碎，全程20~25min！ f.破碎完的蛋白離心之后要立即純化，因?yàn)槠扑楹�，樣液中可能有許多蛋白酶，長時間放置會降解蛋白！ 建議你一下：你破碎完之后的上清上樣量上少點(diǎn)！太模糊了，不利于你觀察！我看了一下，你那還是有點(diǎn)蛋白的！只是太模糊了，而且你也沒過柱純化！沒起到富集的作用！ |
4樓2013-05-10 22:46:17
小孩5406
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 0.5
- 帖子: 82
- 在線: 23.4小時
- 蟲號: 1986045
- 注冊: 2012-09-08
- 專業(yè): 免疫生物學(xué)
5樓2013-05-12 12:48:59
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 找調(diào)劑 +6 | 楚喬喬 2026-04-01 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 材料工程322分 +8 | 哈哈哈吼吼吼哈 2026-04-01 | 8/400 |
|
|
[考研] 化工調(diào)劑303分，過四級 +5 | 棲梧待風(fēng) 2026-04-02 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 08開頭看過來�。。� +4 | wwwwffffff 2026-03-31 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 372求調(diào)劑 +3 | jj涌77 2026-04-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿211，335分，0856，求調(diào)劑院校和導(dǎo)師 +14 | 傾____蕭 2026-03-27 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 一志愿北京科技，085601總分305求調(diào)劑 +9 | 半生瓜！ 2026-04-01 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 285求調(diào)劑 +11 | AZMK 2026-04-01 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 省雙一流重點(diǎn)一本大學(xué)招收調(diào)劑 +4 | wwwwffffff 2026-03-31 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿鄭大085600，310分求調(diào)劑 +6 | 李瀟可 2026-03-26 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料專碩322分 +9 | 哈哈哈吼吼吼哈 2026-04-01 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 張芳銘-中國農(nóng)業(yè)大學(xué)-環(huán)境工程專碩-298 +9 | 手機(jī)用戶 2026-03-26 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 一志愿華東師范大學(xué)有機(jī)化學(xué)專業(yè)，初試351分，復(fù)試被刷求調(diào)劑! +9 | 真名有冰 2026-03-29 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 080500-315分復(fù)試調(diào)劑 +9 | 上岸3821 2026-03-31 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 282求調(diào)劑 不挑專業(yè) 求收留 +4 | Yam. 2026-03-30 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 370求調(diào)劑 +3 | 080700調(diào)劑 2026-03-30 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 327求調(diào)劑 +5 | 小卡不卡. 2026-03-29 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿中南大學(xué)化學(xué)0703總分337求調(diào)劑 +6 | niko- 2026-03-27 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 085600，專業(yè)課化工原理，321分求調(diào)劑 +5 | 大饞小子 2026-03-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +7 | 墨墨漠 2026-03-27 | 7/350 |
|