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小孩5406新蟲 (小有名氣)
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[求助]
同一個蛋白誘導(dǎo)之后大小變小了，而且超聲過后就沒有了，這是什么情況？求指導(dǎo)！
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我最近在做蛋白誘導(dǎo)，可是同樣一個蛋白，之前師姐做的時候很順利，都能純化出來，可是現(xiàn)在我發(fā)現(xiàn)我誘導(dǎo)之后蛋白比之前師姐誘導(dǎo)的變小了，不知道是什么情況？質(zhì)粒做過酶切也測過序，都是正確的，有沒有人知道這是什么情況，我該怎么辦？快糾結(jié)死了~做了快兩個月了，一直沒進展。 我誘導(dǎo)之后（用箭頭指示的）.png 師姐誘導(dǎo)之后（用箭頭指示）.png 超聲過后我誘導(dǎo)的蛋白就沒有了.png |
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樓主！我來說幾點，希望能給你點建議： 1.同樣的蛋白在不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠上，呈現(xiàn)的電泳圖是不一樣的；即使是同濃度的凝膠，不同的電泳條件，如有人喜歡恒壓，而有人選擇恒流，導(dǎo)致結(jié)果可能出現(xiàn)細(xì)微的差別。只要在準(zhǔn)確分子量上下浮動不大，一般問題是不大的，那可能就是你的蛋白。 2.你的蛋白是有GST標(biāo)簽的吧？你可以利用GE的GST柱純化，得到蛋白的純度應(yīng)該是挺高的，將得到的蛋白再做個western blotting。如果你還有HIS標(biāo)簽，可以建議你做HIS的western blotting，his的特異性可能GST的好些！而且GST的標(biāo)簽容易斷裂，導(dǎo)致蛋白降解！ 3.如果你還不敢確定，你可以先跑個SDS-PAGE，染色后，切膠送Modi-tof，根據(jù)多肽質(zhì)譜圖來確定了！ 4.破碎，本人還是有點小經(jīng)驗的，與你分享下吧！ a.超聲破碎整個過程需要在冰水混合物的冰浴上進行！水不要多也不要太少！ b.破碎前，加少量溶菌酶和核酸酶。溶菌酶可以減少破菌時間，核酸酶可以水解核酸。還可以加點還原劑，如果你的半胱氨酸較多的話；也可以加點蛋白酶抑制劑！ c.超生破碎參數(shù)要設(shè)置恰當(dāng)，一般間隙需要是超聲的2倍，建議選擇6s間隙，和3s破碎！如果樣品量少于100ml， 建議500W超聲20min，大概就行了！溶液就澄清了，不會那么粘！��！如果渾濁，但不粘，可能是包涵體！ d.破碎時，溫度要控制好！過10min，攪拌一下樣品，不要使樣液溫度很高，碰一下燒杯壁就能感覺到！如果溫度高，那就先暫停一下，等溫度降低，并且確保在冰浴中！或者改變超聲參數(shù)，改為10s間隙，5s破碎，全程20~25min！ f.破碎完的蛋白離心之后要立即純化，因為破碎后，樣液中可能有許多蛋白酶，長時間放置會降解蛋白！ 建議你一下：你破碎完之后的上清上樣量上少點！太模糊了，不利于你觀察！我看了一下，你那還是有點蛋白的！只是太模糊了，而且你也沒過柱純化！沒起到富集的作用！ |
4樓2013-05-10 22:46:17
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