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Pushing2012金蟲 (正式寫手)
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[求助]
原核表達(dá)蛋白變小
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| 本人用原核Rosetta，載體PET30做蛋白原核表達(dá)，目的基因992bp，預(yù)測蛋白大小41kda，每次誘導(dǎo)表達(dá)SDS檢測，都出現(xiàn)蛋白變小，與對照相比，在27kda左右出現(xiàn)一個非常明顯的帶，以及在37kda左右出現(xiàn)一個不是特別明顯的帶，但仔細(xì)看還是能看到，在41kda左右沒有新條帶產(chǎn)生，求解。 另外，第一次做表達(dá)用的是BL21，當(dāng)時只出現(xiàn)37kda的帶，鎳柱純化后 純化得到的蛋白SDS檢測又在41kDa,真讓人費(fèi)解，有高人能幫忙解決和解釋下這個問題嗎 |
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2樓2012-05-30 11:00:39
roomofxw
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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1.酶活啊，binding啥的如果滿足需求了，一般就不折騰了。文獻(xiàn)中是不是有類似情況描述。 2.產(chǎn)量是否能夠?qū)?yīng)上，純化后的41kDa是否就是原先37kDa的條帶，還是看不到的條帶的富集。 3.換了菌株，表達(dá)條件，破菌條件不同有可能會造成表達(dá)中止或斷裂，降解，可以設(shè)計N，C的his tag用來檢測。再換其他的，或者換回去。 4.同一個蛋白，由于結(jié)構(gòu)的不同，在SDS上面是有可能跑出不同大小的。也不排除純化條件產(chǎn)生復(fù)性效果，造成結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常。雖無明顯變復(fù)性過程，但是畢竟鹽濃度，pH甚至暴漏在空氣中時間不同，也不絕對說沒用可能吧。 5.既然已經(jīng)純化出來了，那做N,C端測序最有保證了  |
3樓2012-05-30 11:45:57
Pushing2012
金蟲 (正式寫手)
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4樓2012-05-30 16:32:14
5樓2012-05-30 22:36:28
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