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大家?guī)臀铱匆灰幌逻@一對(duì)引物可用嘛？一般引物要達(dá)到啥樣的標(biāo)準(zhǔn)~~~最近一直使用這對(duì)引物PCR，一直沒有條帶，會(huì)不會(huì)是引物的原因啊？下面是用DNAMAN來評(píng)估的結(jié)果，望大家?guī)兔o出意見~~~
Two primers complementarity.
Max complementarity in continuous: 5 bp, free energy=-2.00 Kcal/mol
5'-GGATCCATGTCAACAGTTTTTGTTAATG-3'
                  |||||
3'-GAGACAACTAACTAACTTGAAACAGCTG-5'

Max complementarity in discontinuous: 9 bp
            5'-GGATCCATGTCAACAGTTTTTGTTAATG-3'
               || |  |||| ||
3'-GAGACAACTAACTAACTTGAAACAGCTG-5'

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小松

1樓 2013-05-10 15:39:09

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意孤城_

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gyesang: 回帖置頂 2013-05-11 14:54:09

P不出來不單單是引物的問題，你的目的條帶多少?zèng)Q定你的延伸時(shí)間，反應(yīng)體系合不合理，引物和模版的量合不合適，退火溫度行不行都要考慮。

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3樓2013-05-11 10:06:15

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cicelyzh

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引物做什么用？熒光定量的話肯定不行的。一般的克隆應(yīng)該可以。

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2樓2013-05-11 07:01:11

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你的反應(yīng)條件怎么設(shè)置的，產(chǎn)物大小是多少？這個(gè)可能影響你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外你的引物二聚體有點(diǎn)嚴(yán)重啊，如果是定量PCR的話，在重新設(shè)計(jì)一對(duì)吧，還有能確定你的模板好用嗎，內(nèi)參驗(yàn)證過么？有陽性對(duì)照么？

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4樓2013-05-11 13:53:38

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4樓: Originally posted by 86964109 at 2013-05-11 13:53:38
你的反應(yīng)條件怎么設(shè)置的，產(chǎn)物大小是多少？這個(gè)可能影響你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外你的引物二聚體有點(diǎn)嚴(yán)重啊，如果是定量PCR的話，在重新設(shè)計(jì)一對(duì)吧，還有能確定你的模板好用嗎，內(nèi)參驗(yàn)證過么？有陽性對(duì)照么？

產(chǎn)物大小1038bp，不是用來定量的擴(kuò)開放閱讀框，模板內(nèi)參驗(yàn)證很好~~~

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小松

5樓2013-05-11 15:34:45

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5樓: Originally posted by sls19881024 at 2013-05-11 15:34:45
產(chǎn)物大小1038bp，不是用來定量的擴(kuò)開放閱讀框，模板內(nèi)參驗(yàn)證很好~~~...

如果是RT-PCR擴(kuò)增cDNA模板，就有點(diǎn)麻煩了，首先確定你的基因在所用的模板中是高表達(dá)么，設(shè)計(jì)一對(duì)短片段引物驗(yàn)證一下吧，也可以側(cè)面驗(yàn)證獲得的cDNA模板質(zhì)量是否夠好，是否足夠完整，剩下就是調(diào)整PCR程序，最好再設(shè)計(jì)一對(duì)引物同時(shí)做，也可以做二次PCR，如果還不行就利用酶切位點(diǎn)把目的片段分成2段擴(kuò)

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6樓2013-05-13 08:38:11

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2樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-11 07:01:11
引物做什么用？熒光定量的話肯定不行的。一般的克隆應(yīng)該可以。

你好我想問一下，這種參數(shù)要在什么范圍就能夠達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)啊？Two primers complementarity.
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小松

7樓2013-05-15 20:04:30

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7樓: Originally posted by sls19881024 at 2013-05-15 20:04:30
你好我想問一下，這種參數(shù)要在什么范圍就能夠達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)��？Two primers complementarity.
Max complementarity in continuous: 5 bp, free energy=-2.00 Kcal/mol...

也沒有什么固定標(biāo)準(zhǔn)。一般的引物，只要不是連續(xù)超過8bp應(yīng)該可以P出來的。而且，互補(bǔ)的位置也會(huì)影響PCR，一般希望引物的3'端最好不要形成互補(bǔ)。如果是做熒光定量，引物的質(zhì)量要求比較高，這些結(jié)構(gòu)越少越好。

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8樓2013-05-15 23:48:00

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