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蛋白透析過(guò)程中出現(xiàn)渾濁
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| 我的目的蛋白是胞內(nèi)可溶表達(dá)，破菌后離心取上清，將破碎上清對(duì)ph7.6的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行透析，透析過(guò)程中透析袋內(nèi)出現(xiàn)渾濁，破菌緩沖液是含0.5M NaCl的ph8.5的Tris-HCl溶液，哪位大俠知道為什么透析過(guò)程中為什么會(huì)出現(xiàn)渾濁，該如何改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案？！ |
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7樓2013-05-12 19:39:55
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【答案】應(yīng)助回帖
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一般我們做蛋白先是破碎，再純化，然后透析！ 雖然不知道你破菌之后，透析蛋白用于干嘛？我猜可能是過(guò)陽(yáng)離子柱是吧？ 1）.因?yàn)槟闫扑橹�，上清中是含有許多種類蛋白的，蛋白濃度越高，protein越容易Aggregated，然后形成沉淀！可能沉淀的并不是你的蛋白，而是雜蛋白！ 我經(jīng)常將一部純化之后！的蛋白流出，放置在4度，第二天觀察發(fā)現(xiàn)蛋白變渾濁了，離了心之后，分別取上清與沉淀電泳，結(jié)果顯示我的蛋白仍在上清！ 2）.通過(guò)透析換buffer來(lái)改變pH，可能會(huì)改變?cè)S多蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象，使蛋白發(fā)生沉淀；也有可能是因?yàn)閜H的改變剛好經(jīng)過(guò)他的等電點(diǎn)，所以發(fā)生了沉淀！如果你的目的蛋白PI值在7.6~8.5之間，那么沉淀的可能是你的蛋白····· 3). 你的破碎buffer中含有500mM的鹽，不知道你的透析buffer中含不含有？ 總之，我也不知道你沉淀的蛋白是否是你的蛋白，你需要將其離心之后，分別取上清和沉淀跑一次SDS-PAGE！ 你的方案得改進(jìn)： 1. 最好在你的目的蛋白前加個(gè)標(biāo)簽，His或GST的。如果就只需要目的protein�。。∧蔷驮跇�(biāo)簽之后加個(gè)酶切位點(diǎn)吧！經(jīng)過(guò)一步純化之后，蛋白的濃度和純度都會(huì)得到提高，一步純化之后再透析不遲��！ 2.透析還是比較慢的，建議你用脫鹽柱G25換你的buffer！ 就這么多吧，希望能給你點(diǎn)建議！ |
2樓2013-05-11 15:35:50
zhoupeng87
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3樓2013-05-11 15:50:59
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