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[交流] 連接轉(zhuǎn)化交流貼

大家把自己連接轉(zhuǎn)化遇到的困難以及經(jīng)驗寫下來吧，

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1樓 2013-05-15 22:09:17

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sunnyboylg

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這幾天做質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，一直沒長出菌來，我想想估計是質(zhì)粒酶切跑電泳切膠回收濃度太低了，都沒有多少質(zhì)粒轉(zhuǎn)進去，而且感受態(tài)細胞濃度也不夠高�？傊际菨舛鹊腿堑牡�

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2樓2013-05-15 22:17:56

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yiloutingyu

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已經(jīng)做了一個月了，還是沒做出來，一直涂板長不出來，后來找到原因，是大腸桿菌的原因，換了做場感受態(tài)之后，能長出來，挑單菌落后搖不起來。就這樣耗著，前面都沒問題，我也各種驗證，現(xiàn)在在懷疑我的感受態(tài)試劑盒。連接以前是在16度水浴過夜，現(xiàn)在換成4度冰箱里冰浴過夜，效果好一些。在轉(zhuǎn)化的過程中，最好是42度熱擊90秒。

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4樓2013-05-15 23:22:07

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光樹林

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回收濃度確實有一定的影響，主要是最好16度多連接一會兒，過夜挺好的

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5樓2013-05-16 00:00:05

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cicelyzh

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有時候感受態(tài)細胞不是特別理想。自己制備的感受態(tài)用氨芐的抗性板有時候負對照會長克隆。

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6樓2013-05-16 06:45:36

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我的也是，最近一段時間做轉(zhuǎn)化，菌P時候有條帶，但是培養(yǎng)之后提取質(zhì)粒后酶切，沒有目的條帶。做了幾次都是這樣，感覺應(yīng)該是轉(zhuǎn)化除了什么問題

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7樓2013-05-16 08:27:21

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shenmh_1987

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1.感受態(tài)質(zhì)量要有保障，實在不行就用商業(yè)化的感受態(tài)，免得在連接轉(zhuǎn)化這種小問題上糾結(jié)好久
2.連接時片段載體比例要適中
3.轉(zhuǎn)化過程中不能讓感受態(tài)受熱，熱激時間根據(jù)感受態(tài)不同嚴格把握
4.熱激后迅速放于冰上，且避免震動。

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8樓2013-05-18 19:57:19

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個人覺得電轉(zhuǎn)化的效率比化學轉(zhuǎn)化的效率高出許多，并且，操作還簡單

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10樓2013-05-19 09:34:27

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莓林塔

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引用回帖:

10樓: Originally posted by 20083630zhan at 2013-05-19 09:34:27
個人覺得電轉(zhuǎn)化的效率比化學轉(zhuǎn)化的效率高出許多，并且，操作還簡單

TA連接的體系本身就是高離子濃度的，不適宜用電轉(zhuǎn)啊，電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)個質(zhì)粒啥的還是不錯的。。而且我昨天也電轉(zhuǎn)了，還是沒長�。�！好討厭啊，還沒找到原因。。。

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11樓2013-05-19 14:43:11

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莓林塔

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我的現(xiàn)在就出鬼了一樣，我老師現(xiàn)在只能安慰我說，會做出來的，總會做出來的

繼續(xù)找原因吧，哎

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12樓2013-05-19 14:45:03

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11樓: Originally posted by 莓林塔 at 2013-05-19 14:43:11
TA連接的體系本身就是高離子濃度的，不適宜用電轉(zhuǎn)啊，電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)個質(zhì)粒啥的還是不錯的。。而且我昨天也電轉(zhuǎn)了，還是沒長�。�！好討厭啊，還沒找到原因。。。...

我用的載體是PUC19，感覺電轉(zhuǎn)化效率比化學方法好，但是，最近挑單菌落PCR偶條帶，提取質(zhì)粒酶切總是沒有條帶，好桑心啊

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13樓2013-05-20 11:17:46

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hanyueV5

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4樓: Originally posted by yiloutingyu at 2013-05-15 23:22:07
已經(jīng)做了一個月了，還是沒做出來，一直涂板長不出來，后來找到原因，是大腸桿菌的原因，換了做場感受態(tài)之后，能長出來，挑單菌落后搖不起來。就這樣耗著，前面都沒問題，我也各種驗證，現(xiàn)在在懷疑我的感受態(tài)試劑盒 ...

我的也是，前面都沒問題，就是轉(zhuǎn)化的單菌落搖不起來，要不就是出現(xiàn)大量的空載體，甚至是連載體都沒有的假陽性，而且我的還是兩個不同的實驗，不同的材料····這到底是什么原因什么原因，我嚴重懷疑是轉(zhuǎn)化出問題了，可這都是實驗室的老方法，以前都ok的啊

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14樓2013-05-20 13:18:39

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14樓: Originally posted by hanyueV5 at 2013-05-20 13:18:39
我的也是，前面都沒問題，就是轉(zhuǎn)化的單菌落搖不起來，要不就是出現(xiàn)大量的空載體，甚至是連載體都沒有的假陽性，而且我的還是兩個不同的實驗，不同的材料····這到底是什么原因什么原因，我嚴重懷疑是轉(zhuǎn)化出問題 ...

我今天剛用氯化鈣法重新做了感受態(tài)，已經(jīng)轉(zhuǎn)化了，看明天的結(jié)果吧。

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15樓2013-05-20 20:25:18

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簡單回復(fù)

yingying15883樓

2013-05-15 22:48 回復(fù)

wandsy9樓

2013-05-18 21:32 回復(fù)

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