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wangjunwiner

金蟲 (初入文壇)

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專業(yè): 分子與進(jìn)化生態(tài)學(xué)

[求助] 煙草反轉(zhuǎn)錄PCR 求助

我要做煙草的反轉(zhuǎn)錄PCR，檢測一種酶在RNA水平的轉(zhuǎn)錄量。但是我是一個新手，上面也沒有人指導(dǎo)。所有的東西都要重新購買
求各位網(wǎng)友從購買需要的試劑，耗材開始指導(dǎo)下。我要從提取總RNA開始做。PCR出來相關(guān)酶的表達(dá)量和一個內(nèi)參。
再次感謝大家。

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反轉(zhuǎn)錄要求42度30分鐘，85 度5分鐘，如果在pcr儀上進(jìn)行，蓋子的溫度要不要設(shè)置。已經(jīng)有28人回復(fù)
提取RNA后，反轉(zhuǎn)錄后用β-actinpcr很多條帶已經(jīng)有20人回復(fù)
rna終于提取出來了，可是反轉(zhuǎn)錄pcr（rt pcr）沒有條帶已經(jīng)有19人回復(fù)
反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，為什么還要做RT-PCR? 已經(jīng)有4人回復(fù)
反轉(zhuǎn)錄之后PCR擴(kuò)增片段問題的請教，急急急已經(jīng)有5人回復(fù)
請教RNA提取高手：反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR)中DNA的去除已經(jīng)有18人回復(fù)
提RNA反轉(zhuǎn)錄后，用GAPDH和TLR進(jìn)行PCR，可是GAPDH條帶很亮，TLR怎么都出不來已經(jīng)有14人回復(fù)
提出來是一回事，提得好是另外一回事-----RNA 已經(jīng)有9人回復(fù)
反轉(zhuǎn)錄后PCR無條帶已經(jīng)有5人回復(fù)
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慢慢來

1樓 2013-05-20 08:49:13

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

植物小蟲

新蟲 (初入文壇)

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專業(yè): 植物生理與生化

【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

本人都是用從生物公司（艾德萊）買的植物RNA專用試劑盒——《RNApure超純總RNA快速提取試劑盒》，提過幾次，效果都很好。提取后做RT-PCR，第一鏈的合成用的Primer是oligo(dT)18 prime
反應(yīng)體系：
RNA模板：0.1ng-5ug
Oligo(dT)18 1ul
Water,nuclease-free 至12ul 65攝氏度5分鐘，這步是為了消除發(fā)卡結(jié)構(gòu)
然后加5X Reaction Buffer 4ul
Ribolock RNase inhibitor(20u/ul) 1ul
10mM dNTP Mix 2ul
ReverAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200u/ul) 1ul
總共20ul 42度孵育1小時就行

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