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DGGE 垂直電泳 灌膠技術(shù) 各位大俠幫幫忙
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想確定變性劑的梯度范圍，請(qǐng)問DGGE垂直電泳的膠是怎么灌的呢，梯度變化是水平的，那怎么灌呢�？戳艘粋�(gè)文獻(xiàn)貌似說也是用伯樂的小車，一管高，一管低，那梯度是怎么形成的呢。那和我們平時(shí)跑得正常的DGGE 也就是水平的DGGE 灌膠不就是用小車灌的嗎？ 第二個(gè)是我每次灌膠拔完梳子之后兩邊的空挺平的，可是中間的膠孔就會(huì)晚上拱形成一個(gè)弧度，那在這樣的孔里加樣跑出來的條帶都不直，還有做膠是空附近還總是有氣泡。 大家看看我這圖，我總感覺條帶沒分開，是電泳時(shí)間影響還是變性劑的梯度范圍 我的條件是180v,6h，變性劑30-60%,上樣量25ul。 MARKER也會(huì)變性，怎么標(biāo)注呢。 新手問問大家有沒有什么小技巧或注意事項(xiàng)。請(qǐng)大家賜教謝謝 1.JPG |
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老夏853
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8樓2013-05-26 16:31:19
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【答案】應(yīng)助回帖
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制備平行膠： 平行膠中從上至下變性劑的濃度遞增。這種膠適用于分析大量樣品。 1) 與制備標(biāo)準(zhǔn)聚丙烯胺凝膠一樣制備膠板。 2) 從丙烯酰胺和兩種變性劑貯存液中取兩份等體積溶液以符合要求的變性劑濃度范圍。溶液的總體積一般為剛好覆蓋膠板。丙烯酰胺的濃度取決于DNA 片段的大小，對(duì)于DNA 片段大小為≥300bp 的丙烯酰胺的濃度為6%， 而長(zhǎng)度＜300bp 的DNA 片段，丙烯酰胺的濃度為12%。 3) 加高濃度變性劑溶液到梯度生成器右槽中(該溶液將首先通過梯度合成器進(jìn)入膠板間的空隙)，打開連接梯度生成器兩端的開關(guān)，讓一些溶液流入左槽內(nèi)關(guān)上開關(guān)，用吸管把它們移回到右槽(目的是確保兩槽之間無氣泡的阻隔)。然后把低濃度變性劑溶液加到梯度生成器左槽中。 4) 攪拌這兩個(gè)槽中溶液的同時(shí)向其中加入4.5μL/mLl0%的過硫酸銨和1μL/mL 的TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺)。 5) 輕輕打開兩槽之間的開關(guān)及梯度生成器出口的開關(guān)，灌膠時(shí)兩槽內(nèi)的溶液應(yīng)處于攪拌狀態(tài)(尤其高濃度溶液槽應(yīng)攪拌)，溶液受重力影響通過一個(gè)放在兩塊玻璃板之間的頂部的細(xì)塑料管流過梯度生成器。流速應(yīng)保持一定大小以保證溶液在凝聚之前所有溶液都應(yīng)注入到兩層玻璃板之間。(凝聚速度可通過調(diào)整過硫酸銨和TEMED 的濃度來調(diào)節(jié))。 6) 膠板充滿后，在其頂部插入梳子并將其放平，凝聚至少30min。(膠可事先灌好并于4℃貯存幾天)。 制備垂直膠 垂直膠含有丙烯酰胺的濃度是固定的，垂直于電泳方向有一個(gè)線性遞增的變性劑梯度。這種膠適用于確定分離含有核苷酸改變的DNA 片段的最佳梯度范圍。垂直膠的制備大體相似和平行膠的制備，但也有所不同： 1) 像標(biāo)準(zhǔn)的聚丙烯酰胺凝膠一樣制備膠板，但其頂部不插入梳子。 2) 準(zhǔn)備一塊比梳子稍短的涂上潤(rùn)滑劑的間隔片插在梳子的位置，位置稍突出一些，這樣左邊就留下一個(gè)缺口。用夾子夾緊這一邊。把膠板旋轉(zhuǎn)90°這樣和缺口相連的這一面就轉(zhuǎn)到最上面了。膠液將通過該缺口進(jìn)入兩玻璃板之間。如前所述的方法灌膠。 3) 膠完全凝固之后，將膠板垂直立起，輕輕移出膠頂部的間隔片。膠的頂部就會(huì)出現(xiàn)大而平的孔，這樣就可以進(jìn)行電泳了。 注意： 在混合和灌膠時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。 有時(shí)聚丙烯酰胺凝膠的左側(cè)會(huì)出現(xiàn)縮水現(xiàn)象以致在膠的頂部到底部之間會(huì)產(chǎn)生空氣通道，可用2%熔化的瓊脂糖凝膠將其充滿。 所有溶液應(yīng)保存于4℃棕色瓶中，一般幾個(gè)月到一年內(nèi)有效。 電泳時(shí)凝膠溫度必須保持恒定，要達(dá)到這一要求，可把膠板浸沒于充分?jǐn)嚢璧臏乜鼐彌_液槽內(nèi)。對(duì)于缺乏變性劑時(shí)比較容易變性的DNA 來說，槽內(nèi)的溫度選擇在60℃稍微超過熔點(diǎn)，并且大部分的工作都在60℃下進(jìn)行(但溫度稍高或低一點(diǎn)都可采用)。溫度保持恒定可將電泳緩沖液加熱到60℃，并把膠浸入其中進(jìn)行電泳即可。 |
2樓2013-05-26 01:59:33
3樓2013-05-26 16:01:03
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【答案】應(yīng)助回帖
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mandywang: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-05-26 16:07:22
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首先確定好 變性劑梯度范圍正確的話 建議吧 膠濃度 提高一個(gè)梯度。比如 通常8%的膠 用來跑300 左右的片段 提高到10% 或者更高一點(diǎn)， 這樣再去摸索電泳時(shí)間和電壓組合 通常出來的條帶會(huì)分的比較開 而且形狀也漂亮。 這張圖 做的還不錯(cuò)。不過條帶有點(diǎn)糊 。 要用去離子鍵酰胺 和 去離子水，而且過硫酸銨溶液最好現(xiàn)配 。 瓶子 器皿啥玩意要刷洗干凈。 細(xì)節(jié) 決定成敗 。 |
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mandywang4樓2013-05-26 16:01:21
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