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蛋白質(zhì)氨基酸提取方法請(qǐng)教
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本人不是最近接到導(dǎo)師安排要做個(gè)植物中氨基酸蛋白質(zhì)的提取。 以前都沒(méi)做過(guò)，查了查文獻(xiàn)大部分是用1、水溶液提取法2、有機(jī)溶劑提取法3、加重金屬螯合劑法4、等電點(diǎn)成電法。 可是我這個(gè)氨基酸提取出來(lái)是要做活性研究的，大家懂得，就是天然產(chǎn)物氨基酸蛋白質(zhì)活性研究，所以大神們，幫忙指點(diǎn)下，什么方法比較合適，不破壞結(jié)構(gòu)又盡量不水解。還有我的原材料不溶于水。 |
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志子
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【答案】應(yīng)助回帖
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小孩真酷: 金幣+4, ★★★很有幫助, 好像對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求都挺高的，我們這邊估計(jì)都做不了。 2013-05-29 08:49:53
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也不知道你做提的是什么植物什么功能的蛋白，不好細(xì)答。來(lái)個(gè)通用的，樓主請(qǐng)對(duì)號(hào)入座： 一、植物組織蛋白質(zhì)提取方法 1、根據(jù)樣品重量（1g樣品加入3.5ml提取液，可根據(jù)材料不同適當(dāng)加入），準(zhǔn)備提取液放在冰上。 2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置（3-4小時(shí)）。 3、用離心機(jī)離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清液，樣品制備完成。 蛋白質(zhì)提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 這種方法針對(duì)SDS-PAGE，垂直板電泳！ 二、植物組織蛋白質(zhì)提取方法 氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨葉片 2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過(guò)夜，然后離心（4℃8000rpm以上1小時(shí)）棄上清。 3、加入等體積的冰浴丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇），搖勻后離心（4℃8000rpm以上1小時(shí)），然后真空干燥沉淀，備用。 4、上樣前加入裂解液，室溫放置30分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離心（15℃8000rpm以上1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間以沒(méi)有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)），可臨時(shí)保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆谩?br /> 藥品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。 這種方法針對(duì)雙向電泳，雜質(zhì)少，離子濃度小的特點(diǎn)！當(dāng)然單向電泳也同樣適用，只是電泳的條帶會(huì)減少！ 三、組織：腸黏膜 目的：WESTERN BLOT檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 應(yīng)用TRIPURE提取蛋白質(zhì)步驟： 含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量） 倒轉(zhuǎn)混勻，置室溫10min 離心：12000 g，10min，4度，棄上清 加入0.3M鹽酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量） 振蕩，置室溫20min 離心： 7500g，5 min，4度，棄上清 重復(fù)0.3M鹽酸胍/95％乙醇步2次 沉淀中加入100％乙醇 2ml 充分振蕩混勻，置室溫20 min 離心： 7500g，5min，4度，棄上清吹干沉淀 1％SDS溶解沉淀 離心：10000g，10min，4度 取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的問(wèn)題：加入1％SDS后沉淀不溶解，還是很大的一塊，4度離心后又多了白色沉定，SDS結(jié)晶？測(cè)濃度，含量才1mg/ml左右。 解決：提蛋白試劑盒，另外組織大小適中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分鐘，效果很好的。 四、植物材料：水稻苗，葉鞘，根 1、200毫克樣品置于冰上磨碎 2、加lysis buffer，離心，10000rpm，4度，5min取上清 3、重復(fù)離心5min lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40 五、蛋白質(zhì)樣品制備 秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal等（1986）的方法進(jìn)行。 100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巰基乙醇），混勻，-20℃沉淀1小時(shí)，4℃，15000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀復(fù)溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇)，再于-20℃沉淀1小時(shí)，同上離心棄上清，（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干。 按每mg干粉加入20μl（可調(diào)） UKS液[9.5 M尿素，5mM碳酸鉀，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫蘇糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃溫育30min，期間攪動(dòng)幾次，28度 （溫度低，高濃度的尿素會(huì)讓溶液結(jié)冰）16000 r/min離心15 min，離心力越大時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)越好！上清即可上樣電泳�；蛘�-70度保存 六、植物根中蛋白質(zhì)的抽取 (1) sample, 液氮研磨 (2) 裝1.5 ml centrifuge 用tube (3) 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul (4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite (5) 取上層液，蛋白質(zhì)就在里面 |
2樓2013-05-29 00:59:59
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