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小李愛學(xué)習(xí)銀蟲 (正式寫手)
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[求助]
DEAE——Sepharose離子交換純化 流速變慢
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在做DEAE——Sepharose Fast Flow離子交換純化酶的研究，是用的NaCl梯度洗脫，剛開始流速正常，但經(jīng)過7-8小時(shí)后流速就變慢了，需要再次提高泵的轉(zhuǎn)速，之后7-8小時(shí)后再次變慢，需要再次提高泵的轉(zhuǎn)速； 我用的是2年前師姐用過的柱材料，分離效果還不錯，但就是出現(xiàn)流速變慢的情況；蠕動泵是上海滬西的；上樣前樣液已經(jīng)過0.44um膜過濾了；是NaCl濃度逐漸增加導(dǎo)致的問題嗎？我上樣的體積比較大，是不是樣品量太大把柱子堵了?但是梯度洗脫前用緩沖液沖洗雜蛋白的時(shí)候沒有堵�。� 還是別的原因請各位高手給小弟分析分析。 [ Last edited by 小李愛學(xué)習(xí) on 2013-5-29 at 10:42 ] |
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wizardfan: 金幣+3, 謝謝補(bǔ)充 2013-05-31 08:21:19
wizardfan: 金幣+3, 謝謝補(bǔ)充 2013-05-31 08:21:19
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其實(shí)其他人說的都對，都是該考慮的地方，我為何只說泵的原因是因?yàn)槲矣X得你過柱子的裝置。你用的泵是國產(chǎn)的蠕動泵，他的原理就是3個鐵桿旋轉(zhuǎn)推動壓緊的皮管往前出水，流速是通過鐵桿與皮管壓緊程度來控制的，所以我覺得時(shí)間一長他壓緊的程度就不準(zhǔn)了，變松了，流速就慢了。此外3樓4樓說的很對，手動裝的柱子，時(shí)間一長，填料是會被壓縮的，5樓說的是非常正確的，是這個問題的關(guān)鍵�？上銢]法檢測壓力，不好觀察�，F(xiàn)在你能夠得到目標(biāo)蛋白就算順利，考慮下一步試驗(yàn)趕緊做。如果非要改進(jìn)，我覺得你過柱時(shí)間真的太長了，7-8小時(shí)，之后再7-8小時(shí)。蛋白與樹脂結(jié)合力很強(qiáng)可以提高流速，擔(dān)心壓力大壓壞填料的話就換粗一點(diǎn)的柱子。我用GE的5mL預(yù)裝柱，一般流速5mL/min,上樣怕不結(jié)合我會降低到3mL/min,洗脫洗20個柱體積。還是很快的。僅供參考。 |
7樓2013-05-31 00:41:59
ynkuaile
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