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hkxya7金蟲 (小有名氣)
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[求助]
問一下有關(guān)PCR-DGGE割膠回收的一些問題
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| 各位大俠，我現(xiàn)在想做一下PCR-DGGE割膠回收，但是對(duì)這方面不是很了解，具體操作是怎么進(jìn)行的，還有我看文獻(xiàn)上有一步好像是要將載體轉(zhuǎn)接到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞上，我想問一下這一步可不可以不進(jìn)行。還有就是做這個(gè)實(shí)驗(yàn)需要什么試劑盒之類的東西。。。。真的很急，求求哪位在這方面有經(jīng)驗(yàn)的大神能夠幫我一下，再不行就真的畢不了業(yè)了。。。。。 |
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2樓2013-06-05 11:38:53
tangjiliang
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附錄4 普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型） 操作步驟：第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明先在15ml漂洗液PW中加入60ml無水乙醇！所有離心步驟均為試用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。 1. 柱平衡步驟：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500ul平衡液BL，12,000 rpm（~13,400×g）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 2. 將單一的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分）放入趕緊離心管中，稱取重量。 3. 向膠塊中加入3倍體積溶膠液PN；當(dāng)回收的目的片段< 150bp或瓊脂糖凝膠濃度>2%時(shí)，建議使用6倍體積溶膠液PN（如溶膠重為0.1g，其體積可視為100μl，以此類推）。50℃水浴放置10min，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的膠塊，可再補(bǔ)加一些溶膠液或繼續(xù)放置幾分鐘，直至膠塊完全溶解（若膠塊的體積過大，可事先將膠塊切成碎塊）。 注意：膠塊完全溶解后最好將膠溶液溫度降至室溫再上柱，因?yàn)槲街谳^高溫度時(shí)結(jié)合DNA的能力較弱。 4. 將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2min，12,000rpm（~13,400×g）離心30~60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。 注意：吸附柱容積為800μl，若樣品體積大于800μl可分批加入。 5. 向吸附柱CA2中加入700μl漂洗液PW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）離心30~60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。 注意：如果回收的DNA是用于鹽敏感的實(shí)驗(yàn)，例如平末端連接實(shí)驗(yàn)或直接測(cè)序，建議PW加入后靜置2~5min再離心。 6. 向吸附柱CA2中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm（~13,400×g）離心30~60秒，倒掉廢液。 7. 將吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm（~13,400×g）離心2min，盡量除盡漂洗液。將吸附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實(shí)驗(yàn)。 注意：漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。 8. 將吸附柱CA2放到一個(gè)干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，（如果回收的目的片段>10kb,則洗脫緩沖液EB應(yīng)置于65～70℃水浴預(yù)熱），室溫放置2min。12,000rpm（~13,400×g）離心2min收集DNA溶液。 注意：DNA也可以用緩沖液（10mM Tris-Cl，pH8.0）洗脫。為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重復(fù)步驟8. 洗脫體積不應(yīng)小于30μl，體積過少影響回收效率。 洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0～8.5范圍內(nèi)（可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍），pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。 DNA濃度及純度檢測(cè) 回收得到的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。 DNA應(yīng)在OD280處有顯著吸收峰，OD260值為1相當(dāng)于大約50ug/ul雙鏈DNA、40ug/ul單鏈DNA。 OD260/OD280比值應(yīng)為1.7～1.9，如果洗脫時(shí)不適用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會(huì)偏低，因?yàn)閜H值和離子存在會(huì)影響光吸收值，但并不表示純度低。 |
3樓2013-06-06 10:04:01
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