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echochen1017新蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR重復(fù)不出來
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| 之前在3月份PCR除了結(jié)果，并測序，現(xiàn)在重復(fù)，已經(jīng)重復(fù)5天，沒有任何條帶，調(diào)高、調(diào)低模板濃度，并且在冰上加樣，也沒有目的條帶，低濃度樣品在500bp左右出現(xiàn)非特異性條帶，請教這是什么情況呢？ |
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8樓2014-10-27 19:54:48
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+2, 鼓勵交流 2013-06-09 22:04:32
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+2, 鼓勵交流 2013-06-09 22:04:32
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你的PCR出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶和可重復(fù)性低本質(zhì)就是你的PCR的專一性不夠。 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。 其對策有：首先可以調(diào)整鎂離子的濃度， 由5.0mmol/L起以0.05mmol/L為單位逐漸下降至1.0mmol/L，降低鎂離子的濃度無效的話，也可以提高鎂離子濃度，最高不超過10.0mmol/L.調(diào)整引物濃度（你的非特異性擴(kuò)增多，因此應(yīng)適當(dāng)降低引物濃度），適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。適當(dāng)提高退火溫度。 使用熱啟動的PCR.可用石蠟隔離方式：先放引物、模板、緩沖溶液（以上稱為A液）入PCR管，然后加入固體石蠟，75度水浴PCR管5分鐘，目視石蠟完全融化后拿PCR管出水浴鍋室溫下豎直放置約15分鐘，待石蠟重新凝固為固體層后，在石蠟層上加入聚合酶、dNTP、MgCl2、緩沖溶液（以上稱為B液），也就是使固體石蠟層隔離A液與B液在PCR管的上下兩層。反應(yīng)開始后，石蠟再度熔化，反應(yīng)體系形成。每種調(diào)整均可以分梯度進(jìn)行。 一般商用的酶制劑里都還有甘油，酶的用量較大時最好是事先超濾或者透析去除一些甘油。 加入0.01%的BSA，白明膠或者Tritom X-100.也有助于提高PCR反應(yīng)的專一性和可重復(fù)性。以上都不行則要重新設(shè)計引物。 另外，時機(jī)最好用新鮮的，操作注意防止污染。 |
2樓2013-06-08 17:25:06
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3樓2013-06-09 09:36:20
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4樓2013-06-10 01:46:57
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