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yhdchina新蟲 (初入文壇)
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[交流]
怎樣能得到高純度的蛋白？ 已有4人參與
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| 我用Ni離子親和層析純化融合蛋白，6個His標(biāo)簽在載體端，然后柱上用腸激酶4°C過夜將載體與目的多肽切開，純化得到我的目的多肽（約4.2KDa），此多肽是存在于腸激酶緩沖液中的。在中科新生命用RP-HPLC測純度只有50%，不知道怎么回事，怎樣能得到純度>95%的蛋白呢？ |
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
kx444555: 金幣+3, 很詳細(xì)，鼓勵交流 2013-06-09 22:03:41
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kx444555: 金幣+3, 很詳細(xì)，鼓勵交流 2013-06-09 22:03:41
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蛋白質(zhì)的親和層析的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或者蛋白質(zhì)-其他分子相互作用，這樣的相互作用的專一性很高，但是不是100%，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的表面積也就是1000-2000平方埃最多，少一些600平方埃也有，每個氨基酸殘基的表面積大的200平方埃，小的80平方埃，也就是說蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用也就是彼此6-10個氨基酸的表面的分子識別而已，不可能是絕對專一。所以抗體-抗原反應(yīng)還存在交叉反應(yīng)哪。蛋白質(zhì)-其他分子相互作用可能比蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，因?yàn)橹辽儆袡C(jī)和無機(jī)小分子的表面積一般達(dá)不到6個氨基酸殘基的表面積，所以可能分子識別的精確度會相對更低。所以不要完全寄希望于親和層析一步就能完成分離純化，之前之后都應(yīng)該使用別的蛋白質(zhì)分離純化方法。需要注意三個問題： 1.蛋白質(zhì)的親和層析應(yīng)該在蛋白質(zhì)的后期分離時使用，在親和層析之前樣品應(yīng)該用其他方法盡量純化，減少親和層析的分離純化負(fù)擔(dān)。蛋白質(zhì)分離純化的前期處理可用分級離心、沉淀、超濾和透析等粗分離方法；之后的細(xì)分離方法可用離子交換樹脂、分子篩層析、疏水層析等。要不輕易用電泳來分離純化，因?yàn)椴缓脧?fù)性，用電泳做檢測比較好，然后還可以疏水層析和親和層析，親和層析之后可以再用分子篩層析和疏水層析。 2.蛋白質(zhì)的親和層析應(yīng)該不只使用一次，不要完全寄希望于親和層析一步就能完成分離純化。你的親和層析因?yàn)橹苯佑昧四c激酶切斷了（組氨酸）6親和標(biāo)簽，所以無法再重復(fù)親和層析了。實(shí)際上，至少第一次用Ni-（組氨酸）6親和層析不要用腸激酶切斷（組氨酸）6親和標(biāo)簽，而用咪唑分濃度梯度把目的蛋白質(zhì)從Ni-柱洗下來，這樣可以對洗下來的樣品多洗幾次，最后再用腸激酶切斷（組氨酸）6親和標(biāo)簽進(jìn)行蛋白質(zhì)分離提純，這樣純度可以高得多。因?yàn)橛媚c激酶切斷（組氨酸）6親和標(biāo)簽進(jìn)行蛋白質(zhì)分離提純是不可逆的，至此也意味著親和層析的結(jié)束。你要是一上來就用酶切的方法，那么親和層析只用了一次，蛋白質(zhì)純度當(dāng)然高不了。 3.親和層析不是必然的蛋白質(zhì)的分離純化工作的終點(diǎn)。蛋白質(zhì)的親和層析之后也可以再用其他的層析方法和樣品濃縮及凍干方法；必要時甚至可用電泳（如果能夠保證樣品充分回收和活性恢復(fù)的話）。 |
2樓2013-06-09 22:01:01
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