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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 怎樣能得到高純度的蛋白？
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[交流]
怎樣能得到高純度的蛋白？ 已有4人參與
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| 我用Ni離子親和層析純化融合蛋白，6個His標簽在載體端，然后柱上用腸激酶4°C過夜將載體與目的多肽切開，純化得到我的目的多肽（約4.2KDa），此多肽是存在于腸激酶緩沖液中的。在中科新生命用RP-HPLC測純度只有50%，不知道怎么回事，怎樣能得到純度>95%的蛋白呢？ |
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蛋白質的親和層析的基礎是蛋白質-蛋白質相互作用或者蛋白質-其他分子相互作用，這樣的相互作用的專一性很高，但是不是100%，因為蛋白質-蛋白質相互作用的表面積也就是1000-2000平方埃最多，少一些600平方埃也有，每個氨基酸殘基的表面積大的200平方埃，小的80平方埃，也就是說蛋白質-蛋白質相互作用也就是彼此6-10個氨基酸的表面的分子識別而已，不可能是絕對專一。所以抗體-抗原反應還存在交叉反應哪。蛋白質-其他分子相互作用可能比蛋白質-蛋白質相互作用，因為至少有機和無機小分子的表面積一般達不到6個氨基酸殘基的表面積，所以可能分子識別的精確度會相對更低。所以不要完全寄希望于親和層析一步就能完成分離純化，之前之后都應該使用別的蛋白質分離純化方法。需要注意三個問題： 1.蛋白質的親和層析應該在蛋白質的后期分離時使用，在親和層析之前樣品應該用其他方法盡量純化，減少親和層析的分離純化負擔。蛋白質分離純化的前期處理可用分級離心、沉淀、超濾和透析等粗分離方法；之后的細分離方法可用離子交換樹脂、分子篩層析、疏水層析等。要不輕易用電泳來分離純化，因為不好復性，用電泳做檢測比較好，然后還可以疏水層析和親和層析，親和層析之后可以再用分子篩層析和疏水層析。 2.蛋白質的親和層析應該不只使用一次，不要完全寄希望于親和層析一步就能完成分離純化。你的親和層析因為直接用了腸激酶切斷了（組氨酸）6親和標簽，所以無法再重復親和層析了。實際上，至少第一次用Ni-（組氨酸）6親和層析不要用腸激酶切斷（組氨酸）6親和標簽，而用咪唑分濃度梯度把目的蛋白質從Ni-柱洗下來，這樣可以對洗下來的樣品多洗幾次，最后再用腸激酶切斷（組氨酸）6親和標簽進行蛋白質分離提純，這樣純度可以高得多。因為用腸激酶切斷（組氨酸）6親和標簽進行蛋白質分離提純是不可逆的，至此也意味著親和層析的結束。你要是一上來就用酶切的方法，那么親和層析只用了一次，蛋白質純度當然高不了。 3.親和層析不是必然的蛋白質的分離純化工作的終點。蛋白質的親和層析之后也可以再用其他的層析方法和樣品濃縮及凍干方法；必要時甚至可用電泳（如果能夠保證樣品充分回收和活性恢復的話）。 |
2樓2013-06-09 22:01:01
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