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16srDNA銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
如何做2個定點突變（2個終止密碼子換掉）
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讀文獻有幾個問題不太懂，特向各位大神求助 有一段目的基因待表達 (支原體的一段基因，要在大腸桿菌中表達），表達前要把這段基因的2個終止密碼子換掉，文獻中用了3對引物（1對flanking region引物，2對含有mutation引物--每對引物都是overlap的），我的問題是這兩個定點突變是怎么做的？ 希望大神們幫幫忙，小女子拜謝 附上那篇文獻 |
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2013-06-15 18:52:22, 402.03 K
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2樓2013-06-15 21:05:49
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我也不清楚這叫不叫定點突變，就是想把兩個不同位置的終止密碼子換掉，文獻中給的兩對引物是overlap的，但是文獻中引用的文獻9，我看不出有什么關(guān)聯(lián)。。。 再附上文獻9，求大神指導，小女子不勝感激 |
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2013-06-15 21:35:59, 3.48 M
4樓2013-06-15 21:36:14
【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
16srDNA(myprayer代發(fā)): 金幣+1, 贈人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更詳細的解答。 2013-06-16 10:42:46
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我說下我大概瀏覽后對圖1突變方法的理解，，結(jié)合問題回答，看能不能幫助你解決你的問題。 為了把在大腸桿菌是終止密碼子而在來源生物是翻譯為谷氨酰胺的密碼子TAA突變?yōu)镃AA，美國TAA位置應(yīng)該都會設(shè)計一條引物，另外在質(zhì)粒其他有單一限制性內(nèi)切酶識別位點的位置突變成另一種限制性內(nèi)切酶。親本質(zhì)粒和突變引物變性退火延伸擴增。擴增產(chǎn)物用內(nèi)切酶把退火成親本質(zhì)粒（沒有搭上突變引物擴增的原始質(zhì)粒）先切開，轉(zhuǎn)化，切開的親本質(zhì)粒將不會復(fù)制，而一條鏈是親本一條鏈是突變引物擴增的將會在繁殖擴增過程形成帶有兩條鏈相同的突變質(zhì)粒或原始質(zhì)粒。提取質(zhì)粒，再次酶切，把原始質(zhì)粒切開，留下突變質(zhì)粒，再次轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，這次可以應(yīng)該大多數(shù)是突變了的。再用突變形成的新內(nèi)切酶位點進行鑒定。 |
5樓2013-06-16 00:35:22
6樓2013-06-16 01:22:55
sun_in_night
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shanqian1988
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9樓2013-06-17 10:15:08
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10樓2013-06-17 11:32:20
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