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16srDNA銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
如何做2個(gè)定點(diǎn)突變（2個(gè)終止密碼子換掉）
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讀文獻(xiàn)有幾個(gè)問題不太懂，特向各位大神求助 有一段目的基因待表達(dá) (支原體的一段基因，要在大腸桿菌中表達(dá)），表達(dá)前要把這段基因的2個(gè)終止密碼子換掉，文獻(xiàn)中用了3對引物（1對flanking region引物，2對含有mutation引物--每對引物都是overlap的），我的問題是這兩個(gè)定點(diǎn)突變是怎么做的？ 希望大神們幫幫忙，小女子拜謝 附上那篇文獻(xiàn) |
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2013-06-15 18:52:22, 402.03 K
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sun_in_night
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2樓2013-06-15 21:05:49
16srDNA
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3樓2013-06-15 21:23:56
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我也不清楚這叫不叫定點(diǎn)突變，就是想把兩個(gè)不同位置的終止密碼子換掉，文獻(xiàn)中給的兩對引物是overlap的，但是文獻(xiàn)中引用的文獻(xiàn)9，我看不出有什么關(guān)聯(lián)。。。 再附上文獻(xiàn)9，求大神指導(dǎo)，小女子不勝感激 |
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2013-06-15 21:35:59, 3.48 M
4樓2013-06-15 21:36:14
【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
16srDNA(myprayer代發(fā)): 金幣+1, 贈人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更詳細(xì)的解答。 2013-06-16 10:42:46
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我說下我大概瀏覽后對圖1突變方法的理解，，結(jié)合問題回答，看能不能幫助你解決你的問題。 為了把在大腸桿菌是終止密碼子而在來源生物是翻譯為谷氨酰胺的密碼子TAA突變?yōu)镃AA，美國TAA位置應(yīng)該都會設(shè)計(jì)一條引物，另外在質(zhì)粒其他有單一限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的位置突變成另一種限制性內(nèi)切酶。親本質(zhì)粒和突變引物變性退火延伸擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用內(nèi)切酶把退火成親本質(zhì)粒（沒有搭上突變引物擴(kuò)增的原始質(zhì)粒）先切開，轉(zhuǎn)化，切開的親本質(zhì)粒將不會復(fù)制，而一條鏈?zhǔn)怯H本一條鏈?zhǔn)峭蛔円飻U(kuò)增的將會在繁殖擴(kuò)增過程形成帶有兩條鏈相同的突變質(zhì)�；蛟假|(zhì)粒。提取質(zhì)粒，再次酶切，把原始質(zhì)粒切開，留下突變質(zhì)粒，再次轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，這次可以應(yīng)該大多數(shù)是突變了的。再用突變形成的新內(nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行鑒定。 |
5樓2013-06-16 00:35:22
6樓2013-06-16 01:22:55
sun_in_night
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7樓2013-06-16 01:58:49
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myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更詳細(xì)的解答。 2013-06-16 10:43:05
myprayer: 金幣+1, 贈人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更詳細(xì)的解答。 2013-06-16 10:43:05
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少說了點(diǎn)，第一次突變引物退火搭上去延伸后直接用連接酶連接（引物應(yīng)該是磷酸化的）。 個(gè)人覺得，這個(gè)方法步驟多，花費(fèi)的時(shí)間也比較長。內(nèi)切酶的酶切效果要求做得好，連接的效果也要做得好，有時(shí)候不太容易，因?yàn)槲覀兡玫绞值臅r(shí)候，酶的質(zhì)量不夠好。感受態(tài)效率要求應(yīng)該還是比較高的。做多個(gè)點(diǎn)突變有困難，如果點(diǎn)是分開的，估計(jì)只好一次突變一個(gè)點(diǎn)，模板質(zhì)粒選擇來酶切篩選的唯一內(nèi)切酶要來回變。 |
8樓2013-06-16 08:39:45
shanqian1988
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9樓2013-06-17 10:15:08
yujitianqing
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10樓2013-06-17 11:32:20
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