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16srDNA銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
如何做2個(gè)定點(diǎn)突變（2個(gè)終止密碼子換掉）
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讀文獻(xiàn)有幾個(gè)問題不太懂，特向各位大神求助 有一段目的基因待表達(dá) (支原體的一段基因，要在大腸桿菌中表達(dá)），表達(dá)前要把這段基因的2個(gè)終止密碼子換掉，文獻(xiàn)中用了3對(duì)引物（1對(duì)flanking region引物，2對(duì)含有mutation引物--每對(duì)引物都是overlap的），我的問題是這兩個(gè)定點(diǎn)突變是怎么做的？ 希望大神們幫幫忙，小女子拜謝 附上那篇文獻(xiàn) |
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2013-06-15 18:52:22, 402.03 K
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16srDNA
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我也不清楚這叫不叫定點(diǎn)突變，就是想把兩個(gè)不同位置的終止密碼子換掉，文獻(xiàn)中給的兩對(duì)引物是overlap的，但是文獻(xiàn)中引用的文獻(xiàn)9，我看不出有什么關(guān)聯(lián)。。。 再附上文獻(xiàn)9，求大神指導(dǎo)，小女子不勝感激 |
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2013-06-15 21:35:59, 3.48 M
4樓2013-06-15 21:36:14
sun_in_night
木蟲 (小有名氣)
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2樓2013-06-15 21:05:49
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3樓2013-06-15 21:23:56
【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
16srDNA(myprayer代發(fā)): 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更詳細(xì)的解答。 2013-06-16 10:42:46
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我說(shuō)下我大概瀏覽后對(duì)圖1突變方法的理解，，結(jié)合問題回答，看能不能幫助你解決你的問題。 為了把在大腸桿菌是終止密碼子而在來(lái)源生物是翻譯為谷氨酰胺的密碼子TAA突變?yōu)镃AA，美國(guó)TAA位置應(yīng)該都會(huì)設(shè)計(jì)一條引物，另外在質(zhì)粒其他有單一限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的位置突變成另一種限制性內(nèi)切酶。親本質(zhì)粒和突變引物變性退火延伸擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用內(nèi)切酶把退火成親本質(zhì)粒（沒有搭上突變引物擴(kuò)增的原始質(zhì)粒）先切開，轉(zhuǎn)化，切開的親本質(zhì)粒將不會(huì)復(fù)制，而一條鏈?zhǔn)怯H本一條鏈?zhǔn)峭蛔円飻U(kuò)增的將會(huì)在繁殖擴(kuò)增過程形成帶有兩條鏈相同的突變質(zhì)�；蛟假|(zhì)粒。提取質(zhì)粒，再次酶切，把原始質(zhì)粒切開，留下突變質(zhì)粒，再次轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，這次可以應(yīng)該大多數(shù)是突變了的。再用突變形成的新內(nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行鑒定。 |
5樓2013-06-16 00:35:22
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