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254131473銅蟲(chóng) (初入文壇)
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蛋白質(zhì)結(jié)合金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)的確證方法
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1.肌鈣蛋白C和鈣離子結(jié)合位點(diǎn)如何確證？或者類(lèi)似的金屬離子和蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的確認(rèn)的方法。 2.檢測(cè)出的C-和N-端的肽段序列的變化與結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)系。 跪求。。 |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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我把你的問(wèn)題分為三個(gè)問(wèn)題加以討論。 1.肌鈣蛋白C和鈣離子結(jié)合位點(diǎn)如何確證？或者類(lèi)似的金屬離子和蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的確認(rèn)的方法。 答：事先要獲得樣品蛋白質(zhì)的全序列（從數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)該容易查到，實(shí)在沒(méi)有再測(cè)序）。 肌鈣蛋白C一級(jí)結(jié)構(gòu)的的氨基酸全序列中可能與金屬離子形成螯合鍵的氨基酸的位點(diǎn)----在一級(jí)結(jié)構(gòu)中的位置，判定出結(jié)合有金屬離子形成螯合鍵的氨基酸的具體位點(diǎn)。1.根據(jù)目的蛋白質(zhì)的全序列中可能與金屬離子形成螯合鍵的氨基酸的位點(diǎn)----在一級(jí)結(jié)構(gòu)中的位置，判定出結(jié)合有金屬離子形成螯合鍵的氨基酸的具體位點(diǎn)。 2.金屬離子和蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的確認(rèn)的方法。 答：確定金屬離子和蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的確認(rèn)的方法。方法很多了，舉例如下： （1）基于NMR的方法。最簡(jiǎn)單的方法：可以用NMR解析結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)的完全的三維結(jié)構(gòu)，要用自選量子數(shù)不為零的同位素加以標(biāo)記。 （2）基于質(zhì)譜的方法。事先要獲得樣品蛋白質(zhì)的全序列（從數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)該容易查到，實(shí)在沒(méi)有再測(cè)序）；用強(qiáng)的螯合試劑奪取結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)中的金屬離子，得到脫金屬的蛋白質(zhì)分子，然后用超濾除去螯合試劑和金屬離子，剩下脫金屬的蛋白質(zhì)分子；分別用胰蛋白酶有限水解結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)和不結(jié)合結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)，分別過(guò)質(zhì)譜，辨別出m/z不一樣的多肽片段（能夠讀出相對(duì)分子量）的質(zhì)譜峰；用分子篩層析分離出含有金屬的蛋白質(zhì)分子和脫金屬的蛋白質(zhì)分子質(zhì)譜峰不一樣的多肽片段（能夠讀出相對(duì)分子量）；取出以上質(zhì)譜峰不一樣的多肽片段（能夠讀出相對(duì)分子量），進(jìn)行測(cè)序---------測(cè)定一部分知道多肽片段在整個(gè)序列中的位置即可，然后用串聯(lián)質(zhì)譜直接對(duì)于含有金屬離子的肽片段測(cè)序即可判定出結(jié)合有金屬離子形成螯合鍵的氨基酸的具體位點(diǎn)（對(duì)比不含金屬的該段的質(zhì)譜即可知道）。 （3）基于X-ray diffraction的方法。用NMR解析結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)的完全的三維結(jié)構(gòu)，前提是能夠獲得結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)的單晶體。 （4）基于肽譜分析的方法。事先要獲得樣品蛋白質(zhì)的全序列（從數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)該容易查到，實(shí)在沒(méi)有再測(cè)序）；用強(qiáng)的螯合試劑奪取結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)中的金屬離子，得到脫金屬的蛋白質(zhì)分子，然后用超濾除去螯合試劑和金屬離子，剩下脫金屬的蛋白質(zhì)分子；分別用胰蛋白酶有限水解結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)和不結(jié)合結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)，分別過(guò)電泳，辨別出兩次電泳圖上位點(diǎn)不一樣一樣的多肽片段（能夠讀出相對(duì)分子量）的質(zhì)譜峰；挖出位置不一樣的兩側(cè)的電泳圖上的肽斑回收其中肽段；對(duì)電泳圖上位點(diǎn)不一樣的多肽片段進(jìn)行測(cè)序（Edman降解法即可，Edman降解法本身無(wú)法測(cè)定修飾的氨基酸，這本身也是一種信息）---------測(cè)定一部分知道多肽片段在整個(gè)序列中的位置即可，然后根據(jù)目的蛋白質(zhì)的全序列中可能與金屬離子形成螯合鍵的氨基酸的位點(diǎn)----在一級(jí)結(jié)構(gòu)中的位置，判定出結(jié)合有金屬離子形成螯合鍵的氨基酸的具體位點(diǎn)。 3.檢測(cè)出的C-和N-端的肽段序列的變化與結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)系。 答：用C-和N-端的肽段序列的變化后的目的蛋白質(zhì)，用有限水解或者構(gòu)建載體生物合成等獲得。 然后重復(fù)"2"的研究方法。 參考文獻(xiàn)： MMB-173-calcium-binding protein protocols –Vol-2 & Vol-1(free) http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=5940632 個(gè)人意見(jiàn)僅供參考！ |
2樓2013-06-17 10:51:13
凌波麗
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3樓2013-06-17 10:52:34
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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補(bǔ)充五點(diǎn)： 1.如果直接從完整的蛋白質(zhì)中去除螯合的金屬離子，比較困難，可以先進(jìn)行有限酶解，然后根據(jù)事先知道的氨基酸全序列和酶解位點(diǎn)，挑選出可能的螯合的金屬離子的肽片段，用分子篩層析分離，然后侵泡于強(qiáng)的螯合試劑中，去除螯合的金屬離子會(huì)比較容易。 2.去除蛋白質(zhì)分子中的螯合的金屬離子的方法也可以通過(guò)將對(duì)螯合的金屬離子的提供配位鍵的氨基酸的側(cè)鏈加以氧化的方法，而釋放出被螯合的金屬離子 3.我在二樓講的試驗(yàn)方法是通用方法，既不知道金屬離子與蛋白質(zhì)上的哪些氨基酸殘基會(huì)有相互作用，也不知道相互作用形成的鍵是什么類(lèi)型的鍵，甚至不知道結(jié)合了多少金屬離子的情況下使用的通用實(shí)驗(yàn)方法。 4.我在二樓講的試驗(yàn)方法“（4）基于肽譜分析的方法”中的電泳是“雙向電泳”。 5.該實(shí)驗(yàn)方法同樣能夠搬到任何的蛋白質(zhì)被無(wú)機(jī)或有機(jī)小分子共價(jià)修飾的具體位點(diǎn)的確定的實(shí)驗(yàn)方法上。 |
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4樓2013-06-17 22:17:20
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送紅花一朵 |
您好 十分感謝您的幫助 但是因?yàn)槲覄偨佑|這些 實(shí)在不懂的太多 我還想有幾個(gè)問(wèn)題想請(qǐng)教您 1.如果我知道了蛋白的全序列或者N-端的肽段序列 我能使用一些軟件模擬出附圖這種螺旋結(jié)構(gòu) 從而看出那兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)嗎 2.知道了所有可結(jié)合的位點(diǎn)都在哪里 想研究不同濃度金屬離子引起的結(jié)合位點(diǎn)的改變 是不是就可以用簡(jiǎn)便一點(diǎn)的方法只分析涉及結(jié)合位點(diǎn)的肽段來(lái)觀測(cè)不同濃度下的結(jié)合位點(diǎn) 圖片1.png |
5樓2013-06-18 09:33:39
凌波麗
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254131473: 金幣+8, ★★★★★最佳答案, 很熱心，收獲很大 2013-06-18 14:24:30
254131473: 金幣+8, ★★★★★最佳答案, 很熱心，收獲很大 2013-06-18 14:24:30
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第一問(wèn)回答：只有知道蛋白質(zhì)全序列情況下才可能用軟件預(yù)測(cè)出其三維結(jié)構(gòu)，而且不可能100%，能夠達(dá)到50%準(zhǔn)確率就很不錯(cuò)了，只知道其中一部分序列根本無(wú)法進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)或者模擬。 第二問(wèn)回答：不行！因?yàn)榻饘匐x子與蛋白質(zhì)結(jié)合不僅與結(jié)合的氨基酸有關(guān)，而且與整個(gè)蛋白質(zhì)的構(gòu)象有關(guān)，這也是蛋白質(zhì)的生物功能的具體表現(xiàn)之一。所以不能把目的切成小的肽段，分別于金屬離子放到同意溶液中，檢測(cè)結(jié)合情況。而且不同的金屬離子濃度下的蛋白質(zhì)的構(gòu)象本身也并不相同。這會(huì)進(jìn)一步引起目的蛋白質(zhì)結(jié)合金屬離子的能力。 |
6樓2013-06-18 09:47:59
254131473
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9樓2014-07-13 16:56:25
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