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254131473銅蟲 (初入文壇)
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蛋白質(zhì)結(jié)合金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)的確證方法
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1.肌鈣蛋白C和鈣離子結(jié)合位點(diǎn)如何確證？或者類似的金屬離子和蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的確認(rèn)的方法。 2.檢測出的C-和N-端的肽段序列的變化與結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)系。 跪求。。 |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗經(jīng)驗 |
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我把你的問題分為三個問題加以討論。 1.肌鈣蛋白C和鈣離子結(jié)合位點(diǎn)如何確證？或者類似的金屬離子和蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的確認(rèn)的方法。 答：事先要獲得樣品蛋白質(zhì)的全序列（從數(shù)據(jù)庫應(yīng)該容易查到，實(shí)在沒有再測序）。 肌鈣蛋白C一級結(jié)構(gòu)的的氨基酸全序列中可能與金屬離子形成螯合鍵的氨基酸的位點(diǎn)----在一級結(jié)構(gòu)中的位置，判定出結(jié)合有金屬離子形成螯合鍵的氨基酸的具體位點(diǎn)。1.根據(jù)目的蛋白質(zhì)的全序列中可能與金屬離子形成螯合鍵的氨基酸的位點(diǎn)----在一級結(jié)構(gòu)中的位置，判定出結(jié)合有金屬離子形成螯合鍵的氨基酸的具體位點(diǎn)。 2.金屬離子和蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的確認(rèn)的方法。 答：確定金屬離子和蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的確認(rèn)的方法。方法很多了，舉例如下： （1）基于NMR的方法。最簡單的方法：可以用NMR解析結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)的完全的三維結(jié)構(gòu)，要用自選量子數(shù)不為零的同位素加以標(biāo)記。 （2）基于質(zhì)譜的方法。事先要獲得樣品蛋白質(zhì)的全序列（從數(shù)據(jù)庫應(yīng)該容易查到，實(shí)在沒有再測序）；用強(qiáng)的螯合試劑奪取結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)中的金屬離子，得到脫金屬的蛋白質(zhì)分子，然后用超濾除去螯合試劑和金屬離子，剩下脫金屬的蛋白質(zhì)分子；分別用胰蛋白酶有限水解結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)和不結(jié)合結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)，分別過質(zhì)譜，辨別出m/z不一樣的多肽片段（能夠讀出相對分子量）的質(zhì)譜峰；用分子篩層析分離出含有金屬的蛋白質(zhì)分子和脫金屬的蛋白質(zhì)分子質(zhì)譜峰不一樣的多肽片段（能夠讀出相對分子量）；取出以上質(zhì)譜峰不一樣的多肽片段（能夠讀出相對分子量），進(jìn)行測序---------測定一部分知道多肽片段在整個序列中的位置即可，然后用串聯(lián)質(zhì)譜直接對于含有金屬離子的肽片段測序即可判定出結(jié)合有金屬離子形成螯合鍵的氨基酸的具體位點(diǎn)（對比不含金屬的該段的質(zhì)譜即可知道）。 （3）基于X-ray diffraction的方法。用NMR解析結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)的完全的三維結(jié)構(gòu)，前提是能夠獲得結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)的單晶體。 （4）基于肽譜分析的方法。事先要獲得樣品蛋白質(zhì)的全序列（從數(shù)據(jù)庫應(yīng)該容易查到，實(shí)在沒有再測序）；用強(qiáng)的螯合試劑奪取結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)中的金屬離子，得到脫金屬的蛋白質(zhì)分子，然后用超濾除去螯合試劑和金屬離子，剩下脫金屬的蛋白質(zhì)分子；分別用胰蛋白酶有限水解結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)和不結(jié)合結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)，分別過電泳，辨別出兩次電泳圖上位點(diǎn)不一樣一樣的多肽片段（能夠讀出相對分子量）的質(zhì)譜峰；挖出位置不一樣的兩側(cè)的電泳圖上的肽斑回收其中肽段；對電泳圖上位點(diǎn)不一樣的多肽片段進(jìn)行測序（Edman降解法即可，Edman降解法本身無法測定修飾的氨基酸，這本身也是一種信息）---------測定一部分知道多肽片段在整個序列中的位置即可，然后根據(jù)目的蛋白質(zhì)的全序列中可能與金屬離子形成螯合鍵的氨基酸的位點(diǎn)----在一級結(jié)構(gòu)中的位置，判定出結(jié)合有金屬離子形成螯合鍵的氨基酸的具體位點(diǎn)。 3.檢測出的C-和N-端的肽段序列的變化與結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)系。 答：用C-和N-端的肽段序列的變化后的目的蛋白質(zhì)，用有限水解或者構(gòu)建載體生物合成等獲得。 然后重復(fù)"2"的研究方法。 參考文獻(xiàn)： MMB-173-calcium-binding protein protocols –Vol-2 & Vol-1(free) http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=5940632 個人意見僅供參考！ |
2樓2013-06-17 10:51:13
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3樓2013-06-17 10:52:34
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【答案】應(yīng)助回帖
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補(bǔ)充五點(diǎn)： 1.如果直接從完整的蛋白質(zhì)中去除螯合的金屬離子，比較困難，可以先進(jìn)行有限酶解，然后根據(jù)事先知道的氨基酸全序列和酶解位點(diǎn)，挑選出可能的螯合的金屬離子的肽片段，用分子篩層析分離，然后侵泡于強(qiáng)的螯合試劑中，去除螯合的金屬離子會比較容易。 2.去除蛋白質(zhì)分子中的螯合的金屬離子的方法也可以通過將對螯合的金屬離子的提供配位鍵的氨基酸的側(cè)鏈加以氧化的方法，而釋放出被螯合的金屬離子 3.我在二樓講的試驗方法是通用方法，既不知道金屬離子與蛋白質(zhì)上的哪些氨基酸殘基會有相互作用，也不知道相互作用形成的鍵是什么類型的鍵，甚至不知道結(jié)合了多少金屬離子的情況下使用的通用實(shí)驗方法。 4.我在二樓講的試驗方法“（4）基于肽譜分析的方法”中的電泳是“雙向電泳”。 5.該實(shí)驗方法同樣能夠搬到任何的蛋白質(zhì)被無機(jī)或有機(jī)小分子共價修飾的具體位點(diǎn)的確定的實(shí)驗方法上。 |
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2541314734樓2013-06-17 22:17:20
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5樓2013-06-18 09:33:39
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254131473: 金幣+8, ★★★★★最佳答案, 很熱心，收獲很大 2013-06-18 14:24:30
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第一問回答：只有知道蛋白質(zhì)全序列情況下才可能用軟件預(yù)測出其三維結(jié)構(gòu)，而且不可能100%，能夠達(dá)到50%準(zhǔn)確率就很不錯了，只知道其中一部分序列根本無法進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測或者模擬。 第二問回答：不行！因為金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合不僅與結(jié)合的氨基酸有關(guān)，而且與整個蛋白質(zhì)的構(gòu)象有關(guān)，這也是蛋白質(zhì)的生物功能的具體表現(xiàn)之一。所以不能把目的切成小的肽段，分別于金屬離子放到同意溶液中，檢測結(jié)合情況。而且不同的金屬離子濃度下的蛋白質(zhì)的構(gòu)象本身也并不相同。這會進(jìn)一步引起目的蛋白質(zhì)結(jié)合金屬離子的能力。 |
6樓2013-06-18 09:47:59
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