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loveiron新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
面團(tuán)中自由巰基含量測(cè)定
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我要測(cè)定面團(tuán)當(dāng)中的自由巰基含量。用的Ellman方法（蛋白質(zhì)提取后加入DTNB顯色反應(yīng)，測(cè)412nm吸光度）。 這是我的操作。 按照國(guó)標(biāo)方法清洗面筋，然后冷凍干燥，磨粉過(guò)篩后制備得到面筋蛋白粉末。 用10ml 8M尿素-Tris/Hcl溶液 溶解0.1g面筋，磁力攪拌1h。 10000g離心10min，取上清液1 ml 加入4ml 8M尿素-Tris/Hcl，100ul 4mg/ml DTNB. 然后就沒(méi)有顏色反應(yīng)。 面筋蛋白溶液加巰基乙醇和鹽酸胍處理之后，用三氯乙酸沉淀蛋白，結(jié)果鹽酸胍晶體析出，導(dǎo)致后來(lái)不加鹽酸胍了（這個(gè)問(wèn)題又是鬧哪樣！）。沉淀后的蛋白質(zhì)用8M尿素溶解加DTNB有顏色反應(yīng)，說(shuō)明方法沒(méi)問(wèn)題，二硫鍵也存在的好好地。 問(wèn)題出在哪里呢？我用半胱氨酸溶液和DTNB反應(yīng)，有顏色反應(yīng)，說(shuō)明DTNB沒(méi)問(wèn)題。自由巰基容易被氧化，是在制備面筋蛋白的過(guò)程中被氧化了？還是有其他什么原因呢。我看很多中文文章都測(cè)過(guò)，很容易的樣子，可是我一直沒(méi)搞定。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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你是參考國(guó)標(biāo)的么？ Ellman試劑不用tris/HCl 配，應(yīng)該用tris/gly 配。而針對(duì)面筋蛋白的處理液（一般是tris-gly-edta-urea 之類的）最好參考權(quán)威文獻(xiàn)。另外，若是測(cè)蛋白中總巰基一般需要40℃水浴15min-25min充分顯色。 最關(guān)鍵我覺(jué)得是你離心后上清液中水溶蛋白到底有沒(méi)有；若有，巰基有沒(méi)有充分暴露而與DTNB反應(yīng)。 樓主再好好看看參考文獻(xiàn)，理清溶液配置的一些細(xì)節(jié)，重點(diǎn)看看面筋蛋白相關(guān)密切的內(nèi)容。 |
4樓2013-06-29 21:52:56
煜，莫煩惱
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3樓2013-06-29 19:28:32
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5樓2013-07-02 10:23:53
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測(cè)定總巰基含量時(shí)，15 mg蛋白樣品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 緩沖液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。測(cè)定自由巰基含量時(shí)，15 mg樣品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 緩沖液中，而后加入50 μL Ellman 試劑 （DTNB, 即5,5-二硫基雙2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 緩沖液，4 mg/mL），在25℃條件下保溫反應(yīng)60 min, 離心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 處測(cè)定吸光值，以含Ellman 試劑的Tris-Gly 緩沖液為空白對(duì)照。 巰基含量的計(jì)算公式如下： SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C 式中：A —除去試劑空白后樣品的吸光度值 D—稀釋倍數(shù) C—樣品濃度（mg/mL） 問(wèn)題1：上述公式中稀釋倍數(shù)D是怎么算的（具體的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？ 問(wèn)題2：我測(cè)的物質(zhì)為毛發(fā)固體樣品，二硫鍵含量在350μmol/g附近，此種測(cè)試方法是否具有可行性 問(wèn)題3：由于毛發(fā)樣品中含有非水溶性蛋白，又沒(méi)喲測(cè)量二硫鍵含量的更好的方法 |
7樓2015-09-29 09:06:59
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測(cè)定總巰基含量時(shí)，15 mg蛋白樣品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 緩沖液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。測(cè)定自由巰基含量時(shí)，15 mg樣品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 緩沖液中，而后加入50 μL Ellman 試劑 （DTNB, 即5,5-二硫基雙2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 緩沖液，4 mg/mL），在25℃條件下保溫反應(yīng)60 min, 離心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 處測(cè)定吸光值，以含Ellman 試劑的Tris-Gly 緩沖液為空白對(duì)照。 巰基含量的計(jì)算公式如下： SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C 式中：A —除去試劑空白后樣品的吸光度值 D—稀釋倍數(shù) C—樣品濃度（mg/mL） 問(wèn)題1：上述公式中稀釋倍數(shù)D是怎么算的（具體的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？ 問(wèn)題2：我測(cè)的物質(zhì)為毛發(fā)固體樣品，二硫鍵含量在350μmol/g附近，此種測(cè)試方法是否具有可行性 問(wèn)題3：由于毛發(fā)樣品中含有非水溶性蛋白，又沒(méi)喲測(cè)量二硫鍵含量的更好的方法 |
8樓2015-09-29 09:07:14
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測(cè)定總巰基含量時(shí)，15 mg蛋白樣品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 緩沖液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。測(cè)定自由巰基含量時(shí)，15 mg樣品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 緩沖液中，而后加入50 μL Ellman 試劑 （DTNB, 即5,5-二硫基雙2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 緩沖液，4 mg/mL），在25℃條件下保溫反應(yīng)60 min, 離心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 處測(cè)定吸光值，以含Ellman 試劑的Tris-Gly 緩沖液為空白對(duì)照。 巰基含量的計(jì)算公式如下： SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C 式中：A —除去試劑空白后樣品的吸光度值 D—稀釋倍數(shù) C—樣品濃度（mg/mL） 問(wèn)題1：上述公式中稀釋倍數(shù)D是怎么算的（具體的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？ 問(wèn)題2：我測(cè)的物質(zhì)為毛發(fā)固體樣品，二硫鍵含量在350μmol/g附近，此種測(cè)試方法是否具有可行性 問(wèn)題3：由于毛發(fā)樣品中含有非水溶性蛋白，又沒(méi)喲測(cè)量二硫鍵含量的更好的方法 |
9樓2015-09-29 09:07:42
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